Основы биохимии Том 3 - А. Ленинджер 1985
Молекулярные механизмы передачи генетической информации
ДНК: структура хромосом и генов
Краткое содержание главы
Роль ДНК как носителя генетической информации подтверждается целым рядом фактов. Эксперимент Эвери, МакЛеода и Мак-Карти показал, что ДНК, выделенная из одного штамма бактерий, способна проникнуть в клетки другого штамма и трансформировать их, придавая им некоторые наследуемые признаки донора. Опыт Херши и Чейз продемонстрировал, что именно ДНК бактериофага, а не его белковая оболочка несет генетическое сообщение для репликации вируса в клетке-хозяине. Все соматические клетки организма данного вида содержат ДНК с одинаковым нуклеотидным составом, который не зависит ни от питания, ни от условий окружающей среды. Хотя нуклеотидный состав ДНК у разных видов различен, в двухцепочечных ДНК всех видов число остатков аденина всегда равно числу остатков тимина, а число гуаниновых остатков всегда равно числу цитозиновых остатков.
На основании рентгеноструктурного анализа волокон ДНК и принципа комплементарноcти оснований в ДНК Уотсон и Крик пришли к заключению, что нативная ДНК состоит из двух антипараллельных цепей, скрученных в двойную спираль. Комплементарные основания А—Т и G—С образуют с помощью водородных связей пары внутри спирали, а гидрофильный сахарофосфатный остов располагается с наружной стороны макромолекулы. Пары оснований плотно уложены в стопку перпендикулярно длинной оси на расстоянии 0,34 нм друг от друга; на один полный виток двойной спирали приходится приблизительно 10 нуклеотидных пар оснований. Комплементарность цепей в двойной спирали позволяет понять механизм их точной репликации.
При нагревании или при экстремальных значениях pH нативная ДНК обратимо расплетается и ее цепи разделяются. Поскольку пары оснований G=C более стабильны, чем пары А—Т, точка плавления ДНК, богатой парами G=С. выше точки плавления ДНК с большим содержанием пар А=Т. Денатурированная одноцепочечная ДНК из одного вида может образовать гибридный дуплекс с денатурированной одноцепочечной ДНК из другого вида при условии, что нуклеотидные последовательности этих двух цепей имеют хотя бы некоторое сходство (гомологию). На основании эффективности образования таких гибридов судят о возможном родстве разных видов и о гомологии между ДНК и РНК.
У ДНК-содержащих вирусов бактерий единственная двухцепочечная молекула ДНК может быть либо замкнутой в кольцо, либо линейной; некоторые вирусные ДНК, например ДНК фХ174, - это одноцепочечные молекулы. Вирусные ДНК сверхспирализованы, что облегчает их плотную упаковку внутри вириона. Единственная хромосома бактерий представляет собой значительно больший по размеру, ковалентно замкнутый кольцевой дуплекс. Бактериальная ДНК свернута с образованием большого числа петель, каждая из которых сверхспирализована. Эукариотические клетки содержат много хромосом, причем каждая хромосома представляет собой одну очень длинную линейную молекулу ДНК, в 4-100 раз превосходящую по длине единственную хромосому прокариот. Эукариотическая ДНК обматывает белковые частицы, состоящие из нескольких молекул основных белков-гистонов, которые располагаются вдоль ДНК через определенные интервалы. Такие комплексы участков ДНК и гистонов называются нуклеосомами.
Структурные гены - это участки ДНК, которые кодируют полипептидные цепи, тРНК и рРНК. Вирусные ДНК содержат сравнительно небольшое число генов в отличие от ДНК Е. coli, содержащей более 3000 генов. К настоящему времени расположение многах из них в кольцевой хромосоме уже установлено. Бактерии защищают свою собственную ДНК путем метилирования некоторых оснований, расположенных в определенных местах молекулы, с помощью модифицирующих метилаз. При этом чужеродная ДНК, не имеющая этих “опознавательных” метальных групп, разрушается рестриктирующими эндонуклеазами. В эукариотических ДНК присутствует большое число высокоповторяющихся коротких последовательностей, меньшее число более длинных умеренных повторов, которые, как полагают, играют регуляторную роль, и ряд уникальных (неповторяющихся) участков, представляющих собой, видимо, структурные гены. Эукариотические гены содержат вставочные нетранслируемые нуклеотидные последовательности, называемые нитронами, которые вставлены между транслируемыми участками, называемыми экзонами. С помощью недавно разработанных методов были определены нуклеотидные последовательности ряда генов и вирусных ДНК.
ЛИТЕРАТУРА
Общие вопросы
Ayala F., Kiger J. Modem Genetics, Benjamin- Cummings, Menlo Park, Calif., 1980. Прекрасное описание основ генетики.
Komberg A. DNA Replication, Freeman, San Francisco, 1980. Всеобъемлющая и авторитетная монография.
Упаковка
Bauer W. R., Crick F. H. C., White J. H. Supercoiled DNA, Sсi. Am., 243, 118-133, July 1980.
Плазмиды
Novick R. P. Plasmids, Sсi. Am., 243, 102-127, Decemberg 1980.
Ферменты рестрикции-модификации
Nathans D. Restriction Endonucleases, Simian 40, and the New Genetics, Science, 206, 903-909 (1979).
Smith H. Nucleotide Sequence Specificity of Restriction Endonucleases, Science, 205, 455-462 (1979).
Выделение и синтез генов
Khorana Н. G. Total Synthesis of a Gene, Science, 203, 614-625 (1979).
Повторяющиеся последовательности
Britten R. J., Kohne D. E. Repeated Segments of DNA, Sсi. Am., 222, 24-31, April 1970.
Davidson E. H., Britten R. J. Possible Role of Repetitive Sequences, Science, 204, 1052-1059 (1979).
Вставочные последовательности
Catterall J. F., colleagues. The Chick Ovomucoid Gene Contains at Least Six Intervening Sequences, Science, 204, 264-271 (1979).
Crick F. Split Genes and RNA Splicing, Science, 204, 264-271 (1979).
Хроматин и нуклеосомы
Komberg R. D., Klug A. The Nucleosome, Sсi. Am., 244, 52-78, February 1981.
Olins D.E., Olins A. L. Nucleosomes: The Quantum Beyond DNA, Am. Sсi., 66, 704-711 (1978).
Нуклеотидная последовательность ДНК
Fiddes J. C. The Nucleotide Sequence of a Viral DNA, Sсi. Am., 237, 55-67, December 1977. Прекрасное описание того, как была расшифрована нуклеотидная последовательность ДНК фХ174.
Махат А. М., Gilbert W. A New Method for Sequencing DNA, Proc. Natl. Acad. Sei. US, 74, 560-564 (1977).
Reddy V. В., colleagues. The Genome of Simian Virus 40, Science, 200, 494-502 (1978).
Sanger F. Determination of Nucleotide Sequences in DNA, Biosci. Repts., 1, 3-18 (1981).
Исторические вопросы
Gaims J., Stent G., Watson J.D. (eds.). Phage and the Origins of Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1966. Рассказ о начальных этапах развития молекулярной генетики и о некоторых людях, которые способствовали ее расцвету.
Judson Н. The Eighth Day of Creation, Simon and Schuster, New York, 1979.
Оlbу R. The Path to the Double Helix, University of Washington Press, Seattle, 1974.
Watson J. D. The Double Helix, Atheneum, 1968. Рассказ об истории открытия двойной спирали ДНК.
Вопросы и задачи
1. Спаривание оснований в ДНК. В препаратах ДНК, выделенных из двух неидентифицированных видов бактерий, содержание аденина составляет соответственно 32 и 17% общего содержания оснований. Какие относительные количества аденина, тимина и цитозина вы предполагаете найти в этих двух препаратах ДНК? Какие вы сделали допущения? Одна из этих бактерий была выделена из горячего источника (64°С). Какая из ДНК принадлежит термофильной бактерии? На чем основывается ваш ответ?
2. Нуклеотидная последовательность комплементарных цепей ДНК. Напишите нуклеотидную последовательность одной цепи двухцепочечной ДНК, другая цепь которой имеет последовательность (5') ATGCCGTATGCATTC (3’).
3. ДНК человека. Чему равен вес молекулы двухцепочечной ДНК (в граммах) протяженностью от Земли до Луны (~384000 км)? Каждая тысяча нуклеотидных пар двойной спирали ДНК весит 1∙10-18 г. В одном километре содержится 1∙1012 нм, а размер одной пары оснований составляет 0,34 нм. Для сравнения интересно отметить, что в организме человека содержится — 0,5 г ДНК!
4. Какова длина гена рибонуклеази? Какое минимальное число нуклеотидных пар содержится в гене, кодирующем панкреатическую рибонуклеазу (124 аминокислоты)? Почему число нуклеотидных пар может оказаться гораздо большим, чем в вашем ответе? С чем связана такая неопределенность?
5. Упаковка ДНК в вирусе. Молекулярная масса ДНК бактериофага Т2 равна 130 ∙ 106. Головка фага имеет размер 100 нм. Считая, что молекулярная масса одной пары оснований равна 660, определите длину ДНК фага Т2 и сравните ее с размером головки фага. Ваш ответ покажет необходимость очень компактной укладки ДНК в вирусах.
6. Упаковка ДНК в эукариотических клетках. Сравните длину ДНК в одной нуклеосоме с диаметром нуклеосомы, который равен 10-11 нм. Затем сравните длину всей ДНК в клетке человека с диаметром клеточного ядра около 2 мкм. В какой из структур ДНК уложена более компактно?
7. Палиндром. Насколько вероятно, что палиндром, изображенный на рис. 27-28, самопроизвольно примет показанную на этом рисунке крестообразную структуру в изолированной чистой ДНК. Каким мог бы быть ваш ответ, если бы этот палиндром находился в хромосоме интактной клетки?
8. ДНК фага М13. ДНК бактериофага М13 имеет следующий нуклеотидный состав: А - 23%, Т 36%, G - 21%, С - 20%. Что говорят вам эти цифры о ДНК данного фага?
9. Разделение ДНК в градиенте плотности. Центрифугирование в щелочном сахарозном градиенте позволяет разделять смесь разных ДНК в соответствии с размерами и формой их макромолекул, но при этом происходит денатурация ДНК. С помощью этого метода можно отличать линейную форму ДНК от кольцевой и определять относительные размеры фрагментов ДНК. Репликативная форма II (РФП) ДНК фага фХ174 представляет собой двухцепочечное кольцо с разрывом в одной из цепей.
а) Какого типа и какой длины молекулы должны выявляться при центрифугировании РФП ДНК в щелочном сахарозном градиенте? (В молекуле ДНК фХ174 содержится 5386 пар оснований.)
б) Какого типа и какой длины молекулы будут обнаружены, если РФП ДНК сначала обработать рестриктирующей эндонуклеазой, расщепляющей РФП только в одном сайте?
10. Нуклеотидная последовательность ДНК. Почему при секвенировании ДНК химическим методом молекула ДНК должна быть меченой только по одному концу, а не равномерно?
11. Нуклеотидный состав ДНК фХ174. ДНК бактериофага фХ174 может находиться в двух формах: в одноцепочечной (в вирионе) и в двухцепочечной (в ходе репликации в клетке-хозяине). Как вы думаете, одинаков ли нуклеотидный состав у этих двух форм ДНК? Обоснуйте свой ответ.
12. Размер эукариотических генов. В печени крысы имеется фермент, В полипептидную цепь которого входит 192 аминокислотных остатка. Этот фермент кодируется геном, включающим 1440 пар оснований. Объясните взаимосвязь между числом аминокислотных остатков в ферменте и числом пар оснований в соответствующем ему гене.
13. Видовые различия ДНК. Если пробирки, содержащие препараты ДНК, выделенные из Е. coli и из морского ежа (табл. 27-3), будут случайно перепутаны, то как вы определите, где какой препарат?
14. “Глазки” в частично денатурированной ДНК. Образец двухцепочечной линейной ДНК, тщательно выделенной из одного вида ракообразных, нанесен на сетку при 20°С и проанализирован с помощью электронного микроскопа. Другой образец этой же ДНК предварительно выдержан при 60°С в течение 30 мин, а затем также проанализирован с Помощью электронной микроскопии. Вот как схематически выглядели эти образцы:
Как вы объясните такой результат? Какую полезную информацию можно извлечь из наблюдаемого явления?
15. Гибридизация ДНК. На основании какой информации о структуре гомологичных белков вы можете предположить, что цепи ДНК из разных видов позвоночных будут давать двухцепочечные гибриды?
16. Действие рестриктирующих эндонуклеаз. Замкнутую кольцевую вирусную ДНК обрабатывают рестриктирующей эндонуклеазой. В этой ДНК есть один сайт рестрикции со следующей структурой:
а) Отметьте точкой предполагаемый центр сайта рестрикции.
б) Почему вы решили, что выбранная вами точка представляет собой центр? Каковы его свойства?
в) После расщепления обеих цепей рестриктирующей эндонуклеазой смесь нагревают, чтобы разрушить фермент, а затем медленно охлаждают. Под электронным микроскопом вирусная ДНК выглядит как кольцевая молекула. Как вы это объясните?
г) Если конечный раствор из предыдущего вопроса (п. в) подщелочить 0,1 М NaOH, то окажется, что в нем находятся лишь одиночные линейные цепи ДНК. Как вы объясните этот факт?
17. РНК-содержащие вирусы: могут ли гены состоять из РНК? В составе РНК-содержащих вирусов Е. coli ДНК нет, в них присутствует лишь РНК, которая выполняет роль вирусной хромосомы. Это означает, что в таких вирусах гены состоят из РНК, а не из ДНК. Опровергает ли это центральную догму молекулярной генетики? Обоснуйте свой ответ.