Биохимия аминокислот - А. Майстер 1961

Природные аминокислоты
Получение оптических изомеров аминокислот

Аминокислоты можно получить из природных материалов или приготовить путем химического синтеза. В первом случае обычно получают L-изомеры аминокислот; аминокислоты, полученные методами химического синтеза (за исключением глицина, ß-аланина и т. п.), представляют собой рацематы. Способы выделения аминокислот многообразны, и этому вопросу посвящена весьма обширная литература. Некоторые белки служат хорошим сырьем для получения определенных аминокислот; клейковина (глютен) пшеницы служит основным сырьевым материалом для производства L-глутаминовой кислоты; глютен кукурузы — хороший источник для выделения L-лейцина и L-тирозина; L-аргинин можно получить из желатины и из крови. Продажные препараты L-аспарагина получают из побегов спаржи (ср. [14]).

Для выделения аминокислот используют различные методические приемы — изоэлектрическое осаждение, выделение в виде солей, сложных эфиров, хлоргидратов, солей сульфокислот, электродиализ, ионофорез. Широкое применение получили методы осаждения аргинина в виде флавианата, глутаминовой кислоты — в виде хлоргидрата, аспарагиновой кислоты — в форме тригидрата медной соли, метионина — в виде ртутного комплекса [116, 494—496].

Нет сомнения в том, что из гидролизатов белков могут быть получены высокоочищенные L-аминокислоты. Тем не менее продажные препараты аминокислот зачастую загрязнены аминокислотными примесями, которые могут быть источником экспериментальных ошибок. В связи с этим микробиологи при приготовлении сред для определения аминокислот посредством бактерий нередко предпочитают применять синтетические DL-аминокислоты, а не L-изомеры, выделенные из белковых гидролизатов. Можно привести следующие примеры часто встречающихся загрязнений: в полученных из белков препаратах лейцина и глутаминовой кислоты часто содержатся метионин, а в препаратах глутамина — аргинин и аспарагин; препараты триптофана бывают загрязнены тирозином, а препараты тирозина — цистином. Выделенный из гидролизатов изолейцин обычно содержит лейцин, и наоборот. Развитие современных хроматографических методов в значительной степени упростило задачу выделения аминокислот, и повсеместное применение этих методов, несомненно, улучшит качество продажных препаратов аминокислот.

В настоящее время разделение синтетических рацематов аминокислот является одним из основных приемов получения L-изомеров и особенно D-изомеров. Большое разнообразие опубликованных методов синтеза аминокислот свидетельствует о многогранном мастерстве химиков, работающих в области органического синтеза. Обсуждение этих методов выходит за рамки настоящей книги; по данному вопросу имеются обстоятельные обзоры [116, 497].

Для получения оптических изомеров аминокислот из соответствующих рацематов разработано несколько методов. Шульце и Босхард, пользуясь плесенью PenicilUum glaucum, получили некоторые D-изомеры путем избирательного разрушения соответствующих L-изомеров (стр. 80). Позднее избирательное воздействие микроорганизмов на L-изомеры соответствующих рацематов было использовано для получения других D-аминокислот (аланин [498], валин [499], глутаминовая кислота [498], изолейцин [498], гистидин [498], тирозин [499], фенилаланин [500] и серин [500]). Введение рацематов некоторых аминокислот в организм животных приводит иногда к выделению D-изомеров с мочой [501]; таким путем был получен D-гистидин [502—503]. Несколько позднее для тех же целей стали применять ферменты. D-Аргинин получен путем обработки DL-аргинина неочищенным препаратом аргиназы [504]. Для получения D-изомеров лейцина, метионина и фенилаланина [505] и L-изомеров аланина [506, 507], метионина [507] и пролина [508] были использованы специфические оксидазы D- и L-аминокислот. D-Лизин [509] и D-глутаминовая кислота [510] были получены путем обработки рацематов специфическими к L-изомерам бактериальными декарбоксилазами.

Механическое разделение кристаллов изомеров имеет весьма ограниченное применение. Исследования Пастера, посвященные избирательному действию Penicillium glaucum и различной растворимости смесей диастериоизомеров, привели в конечном итоге к использованию алкалоидов и ферментов для разделения DL-аминокислот на оптически активные формы. Изомеры аминокислот, меченные изотопными атомами, были получены путем разведения малого количества рацемата аминокислоты большим количеством желаемой оптически активной формы с последующей дробной перекристаллизацией [511, 512].

Фишер [513] впервые применил принцип диастереоизомерии для разделения аминокислот: к N-ацилпроизводному рацемической аминокислоты добавляли оптически активный алкалоид (бруцин, стрихнин, цинхонин, хинидин, хинин), в результате чего возникали две диастереоизомерные формы солей, обладающие различной растворимостью. После разделения этих диастереоизомеров алкалоид регенерировали и ацильную группу удаляли путем гидролиза. Фишеру с сотрудниками [513—515] и позднее другим исследователям [516] удалось разделить этим методом многие DL-аминокислоты. Иногда этот метод можно использовать непосредственно для разделения свободных аминокислот, без предварительного ацилирования аминокислоты и последующего отщепления ацильной группы. Однако все эти методы, как и первоначальный метод Фишера, обладают рядом недостатков: в частности, весьма существенным недостатком является их сугубо эмпирический характер.

В настоящее время наиболее пригодными и удобными методами разделения аминокислот являются методы, основанные на применении стереоспецифических ферментов. Бергман и его сотрудники [517—520] нашли, что папаин в присутствии N-карбобензокси-DL-аминокислот и анилина катализирует синтез анилидов N-карбобензокси-L-аминокислот с большей скоростью, чем синтез соответствующих анилидов D-ряда. L-Анилиды выпадали в осадок первыми, что позволяло разделить изомеры. Позднее этот общий метод получения изомеров аминокислот применяли многие исследователи, используя при этом разнообразные ацилпроизводные и различные ферменты (ср. [521, 522]). Хотя этим методом удается получить чистые изомеры аминокислот, он все же страдает некоторыми недостатками. В частности, фермент может синтезировать анилиды не только L-, но и D-изомеров. Склонность к образованию D-анилидов зависит от строения аминокислоты, природы ацильной группы и других условий. Так как L-анилид обычно образуется быстрее, чем D-форма, очень важно вовремя остановить реакцию. Если реакция обрывается слишком рано, то D-изомер выделяется с примесью L-изомера. Обратное положение возникает в том случае, если оптимальное время реакции превышается. Однако, собирая осадки на протяжении реакции через определенные промежутки времени, можно получить фракции, состоящие из чистых изомеров.

Многие авторы использовали метод разделения изомеров аминокислот путем асимметрического гидролиза их сложных эфиров. В 1906 г. Варбургом было показано, что панкреатин (освобожденный от липазы) гидролизует этиловый эфир DL-лейцина асимметрически; ему удалось выделить из реакционной смеси чистый L-лейцин [523]. Ряд эфиров рацемических аминокислот был разделен при помощи неочищенных препаратов поджелудочной железы, а также кристаллического химотрипсина [524—528]. Ценность этого метода ограничивается склонностью некоторых эфиров аминокислот к самопроизвольному гидролизу, а также к полимеризации в процессе обработки ферментом, с образованием эфиров полипептидов [529].

В настоящее время наиболее ценным общим методом разделения стереоизомеров аминокислот считается метод ферментативного гидролиза ацилированных аминокислот. Стереоспецифичность некоторых гидролитических ферментов в отношении ацилированных аминокислот известна уже давно [530, 531], однако способы применения ферментов для получения D- и L-изомеров аминокислот созданы лишь в последнее время [532, 533]. Общий ферментативный метод разделения рацемических аминокислот, разработанный Гринстайном и др. [534—536, 585], основан на наблюдении, что почечная ацилаза I и карбоксипептидаза, реагируя с рацематами N-ацилпроизводных аминокислот, действуют только на L-изомер. Реакция приходит к концу после гидролиза 50% рацемического продукта. Для разделения образующихся в результате реакции свободной L-аминокислоты и ацил-D-аминокислоты требуется лишь одна операция, так как свободная L-аминокислота нерастворима в неводных растворителях, в которых ацил-D-аминокислота растворяется. Для выделения некоторых аминокислот (пролин, трет-лейцин, а,ε-диаминопимелиновая кислота) применяется аналогичный метод, в котором используют очищенную амидазу. Отделение ацил-D-аминокислоты (или амида D-аминокислоты) от L-аминокислоты можно также осуществить при помощи ионообменного метода [536]. Как правило, используют ацетил- и хлорацетилпроизводные аминокислот; гидролиз ацил-D-аминокислот при кипячении с кислотой не приводит к рацемизации. Представляет интерес тот факт, что ацилпроизводные L-аспарагиновой кислоты гидролизуются специфической ацилазой II, источником которой также служит ткань почек.

Установлено, что при определенных условиях ацилаза I действует на ацетил- и хлорацетил-D-метионин, однако отношение скоростей гидролиза ацилпроизводных L- и D-метионина составляет величину порядка 40000. При использовании трифторацетилпроизводных аминокислот имеет место заметный гидролиз некоторых D-изомеров. Эта ацильная группа, следовательно, непригодна для разделения изомеров при помощи ацилазы I; однако трифторацетилпроизводные ароматических DL-аминокислот асимметрически гидролизуются карбоксипептидазой сока поджелудочной железы [537, 538].

Некоторые наблюдения говорят о принципиальной возможности применения хроматографических методов для разделения изомеров аминокислот. При определенных условиях на хроматограммах кинуренина [539, 540], 2,5-диоксифенилаланина [540]. 2, 3-диоксифенилаланина [540], 3,4-диокси-2-метилфенилаланина [540], фенилглицина [541] и 3-сульфонилтирозина [542] обнаруживаются по два пятна. В опытах с последним веществом пятна были элюированы раздельно, и оказалось, что они образованы двумя оптическими изомерами [542]. Точно так же два пятна, полученные при хроматографировании рацемического кинуренина, соответствовали D- и L-изомерам [539, 540]. Недавно обнаружено, что в системе растворителей метиловый спирт—вода— пиридин DD- и LL-изомеры а,ε-диаминопимелиновой кислоты движутся на хроматограммах с различной скоростью; мезо- и DD-формы обладают одной и той же подвижностью [543]. Имеются также данные о разделении оптических изомеров рацемического монохлоргидрата DL-гистидина [590] и DL-триптофана [591] путем хроматографии на бумаге. В литературе имеются указания [585] о спонтанной кристаллизации одного из изомеров из раствора соответствующего рацемата. Этот прием не находит еще в настоящее время широкого применения для разделения аминокислот, однако возможно, что дальнейшие исследования, направленные на выяснение сущности этого явления, приведут к весьма полезному методу разделения.

Исследования оптической конфигурации аминокислот развиваются в различных направлениях; некоторые из них рассмотрены в настоящей главе, другие будут обсуждены в дальнейших главах, посвященных вопросам обмена аминокислот и их роли в питании. Потребность в оптически чистых изомерах аминокислот для экспериментальных исследований очевидна. Определение удельного оптического вращения имеет значение для характеристики изомеров аминокислот, однако эта методика в большинстве случаев лишена той чувствительности, которая присуща ферментативным методам. Чистоту многих изомеров аминокислот можно проверить при помощи оптически специфических ферментов, таких, как оксидазы D-аминокислот (стр. 184) и L-аминокислот (стр. 187) или специфические к L-изомерам бактериальные декарбоксилазы (стр. 204). Эти методы позволяют обнаружить менее одной молекулы изомера аминокислоты в присутствии 1000 или даже 10 000 молекул ее антипода [544]. Вероятно, при усовершенствовании этих методов легко можно добиться еще более высокой чувствительности.

Многие химические и физические свойства D- и L-изомеров определенной аминокислоты совпадают; у них, например, одинаковы растворимость в оптически неактивных растворителях, ультрафиолетовые и инфракрасные спектры поглощения, точки плавления или разложения, способность к химическим реакциям (с оптически неактивными реагентами). Изомеры аминокислот можно распознавать по оптическому вращению, по реакциям с определенными оптически активными веществами, по их отношению к действию ферментов и иногда хроматографическими методами. Было показано, что оптические изомеры аминокисичный вкус (табл. 8). Подобные наблюдения были сделаны много лет назад Пастером и другими исследователями, но существенного успеха в понимании этого явления до сих пор не достигнуто.

Таблица 8 Зависимость между оптической конфигурацией и вкусовыми свойствами аминокислот *

* По данным рга [545] и автора.

Хотя такого рода наблюдения носят субъективный характер, тем не менее любопытно, что D-изомеры в основном имеют сладкий вкус, тогда как соответствующие L-формы обычно описываются как безвкусные или даже горькие. L-Глутаминовая кислота имеет характерный «мясной» вкус; она находит широкое применение в качестве вкусовой приправы.