Биохимия - Химические реакции в живой клетке Том 3 - Д. Мецлер 1980

Биохимическая генетика и синтез нуклеиновых кислот и белков
Репликация ДНК
Направление репликации

Согласно современным представлениям, репликация ДНК протекает по механизму, приведенному в уравнении (15-3). По мере того как ДНК раскручивается в репликационной вилке, вдоль родительских цепей происходит синтез новых кусков ДНК. Возникает важный вопрос: происходит ли репликация только в одном направлении или же в начальной точке, с которой начинается транскрипция, образуются две вилки, которые далее перемещаются в противоположных направлениях вокруг хромосомы? Ответить на этот вопрос удалось в результате сочетания генетических методов и электронной микроскопии.

Один из методов, использованных для выяснения направления репликации у Е. coli, состоял в следующем. В хромосому бактерии в сайте att (рис. 15-1) встраивали профаг λ, а во многие другие сайты, локализованные вдоль хромосомы, встраивали ДНК фага Мu-1 [189]. Особенно удобно использовать в этом случае фаг Mu-1, поскольку его включение может происходить во многих сайтах, локализованных в пределах хорошо картированных генов. Включение в пределах какого-то гена инактивирует этот ген (мутация добавки), что позволяет точно определить место локализации профага Mu-1. Удалось получить целую серию штаммов бактерий, содержащих как профаги λ, так и фаг Мu-1, причем последний был локализован в различных участках хромосомы. Эти бактерии были, кроме того, ауксотрофны по определенным аминокислотам. Благодаря этому репликацию можно было останавливать, лишая бактерии необходимой аминокислоты. (Однако уже начатый цикл репликации бактерии обычно завершали.) Когда в питательную среду добавляли недостающие аминокислоты, репликация возобновлялась, начинаясь с исходной точки. Одновременно с аминокислотами в среду добавляли бромурацил, включающийся в ДНК вместо тимина. Таким образом, новосинтезированные цепи ДНК имели более высокую плотность, чем исходные. Через разные промежутки времени, проходящего с момента начала репликации¹⁾, вновь образованные цепи ДНК выделяли центрифугированием в градиенте плотности CsCl (гл. 2, разд. 3, 1,д), после чего оценивали их способность гибридизоваться как с ДНК фага λ, так и с ДНК фага Мu-1.

¹⁾ После добавления аминокислот репликация начиналась не одновременно во всех клетках, в связи с чем вновь синтезированные молекулы ДНК имели разную длину.

РИС. 15-28. Двусторонняя направленность репликации хромосомы Е. coli. Радиоавтографическое изображение пары репликационных вилок, полученное на хромосоме, репликация которой осуществлялась в присутствии ³Н-тимина (5 Ки/ммоль), причем на определенной стадии репликации клетки инкубировали в течение 6 мин с ³Н-тимидином с очень высокой удельной радиоактивностью (52 Ки/ммоль). Общая длина линии, содержащей зерна серебра, составляет 370 мкм (Kuempel Р. L. et al., in: DNA Synthesis in Vitro, R. Wells and R. Inman, eds., pp. 463—472, Copyright 1972 University Park Press, Baltimore).

По соотношениям между ДНК фагов Mu-1 и λ для различных штаммов можно было картировать распространение репликации, начиная с исходной точки, расположенной вблизи гена ilv, соответствующего74 мин (рис. 15-1). Было показано, что репликация распространяется в двух направлениях вдоль хромосомы и заканчивается между генами trp и his приблизительно на 25-й мин.

РИС. 15-29. Фрагмент реплицирующейся ДНК хромосомы из разрушенных ядер Drosophila melanogasłer [191]. Расправленная в присутствии формамида ДНК содержит несколько «глазков», образованных в местах репликации РНК. См. рис. 2-23, Б.

Радиоавтографические исследования подтвердили двустороннюю направленность процесса репликации у Е. coli в опытах с использованием особых штаммов ауксотрофов по аминокислотам, характеризующихся низким содержанием нуклеозидтрифосфатов. Добавление аминокислот после голодания вызывало инициацию репликации с лаг-периодом, равным всего 6 мин. Клетки метили ³Н-тимидином, а после того, как репликационные вилки продвигались на небольшое расстояние от места начала репликации, клетки кратковременно метили (импульсная метка) ³Н-тимидином с очень высокой удельной радиоактивностью. При этом на радиоавтографах можно было четко видеть двусторонне направленные репликационные вилки [190] (рис. 15-28). Репликация ДНК в хромосомах дрозофилы была исследована также в быстро делящихся ядрах методом электронной микроскопии [191]. Скорость репликации в этих ядрах оказалась равной приблизительно 300 000 оснований в одну секунду, причем, согласно данным, полученным в этой же работе, репликационные вилки в хромосомах животных не могут двигаться быстрее, чем со скоростью ~50 оснований в секунду. Таким образом, можно было ожидать, что в хромосоме имеется как минимум 6000 вилок или одна вилка на 10 000 оснований. И такое большое число вилок в действительности удалось обнаружить [191]. Вилки появляются попарно, причем при внимательном изучении оказалось, что во многих коротких участках содержится одноцепочечная ДНК, т. е. как будто бы одна цепь в вилке реплицируется быстрее другой. Строение одноцепочечных областей между двумя образующими пары вилками указывает на двустороннюю направленность репликации (рис. 15-29). Репликация в случае Bacillus subtilis также протекает в двух направлениях, однако вилки перемещаются в двух направлениях с разной скоростью [192]. Репликация ДНК фагов λ и Т7 также протекает в двух направлениях [193], тогда как митохондриальная ДНК мыши реплицируется лишь в одном направлении [194].