Биохимия - Химические реакции в живой клетке Том 3 - Д. Мецлер 1980

Биохимическая генетика и синтез нуклеиновых кислот и белков
Рестрикция и модификация ДНК
Рестриктирующие эндонуклеазы

Между вирусами и бактериями беспрестанно продолжается борьба, причем как атакующий фаг, так и бактерия-хозяин пользуются разнообразными орудиями защиты и нападения. Так, например, после вторжения в бактериальную клетку многие вирусы не только выключают синтез клеточной ДНК, «о и разрушают ее благодаря наличию специфических ферментов (как эндонуклеаз, так и экзонуклеаз), синтез которых закодирован в геноме вируса [211—214]. С другой стороны, бактерии-хозяева используют имеющееся у них оружие и часто с его помощью модифицируют ДНК вируса, защищаясь таким образом от его разрушающего действия¹⁾. Так, ферменты, детерминируемые Т-четными фагами, превращают цитидинмонофосфат в 5'-окснметил-СТР, причем модифицированные нуклеотиды обнаруживаются в вирусных ДНК [212]. Более того, вновь образованная гидроксильная группа может быть в различной степени глюкозилирована (гл. 2, разд. Г, 8).

¹⁾ Любопытно, что бактерии развиваются таким образом, чтобы не мешать росту фагов. Многие мутанты, однако (grov), блокируют рост фагов λ, Т3, Т4, Т7 и т. д., но сами растут при этом нормально. Тот факт, что такие бактерии не превращаются з дикий тип, указывает, какое важное значение для бактерии имеет их сосуществование с фагом.

Бактерии часто переваривают и разрушают ДНК вторгшихся в них вирусов или ДНК, попавшую в клетку при спаривании с бактерией несовместимого штамма. В результате исследований этого интересного явления, получившего название рестрикция, было обнаружено, что ДНК вирусов, способных к репликации лишь в определенных клетках- хозяевах, в специфических местах каким-то образом маркирована. Причем во многих случаях метками являются метальные группы. Оказалось, что соответствующим образом метилированная ДНК не расщепляется бактерией, тогда как неметилированная ДНК расщепляется высокоспецифичной эндонуклеазой именно в тех местах, в которых обычно происходит метилирование. У каждого вида бактерий (а часто даже и у отдельных штаммов в пределах данного вида) имеются свои собственные рестриктирующие ферменты. Рестриктирующие ферменты обладают очень высокой степенью специфичности и часто разрезают ДНК всего лишь в нескольких точках (или рядом с ними), для которых характерна уникальная последовательность оснований. В настоящее время удалось выделить около 45 таких ферментов с разной специфичностью.

Рестриктирующие эндонуклеазы, детерминируемые хромосомой Е. coli, — это крупные белки с мол. весом порядка 300 000—400 000, состоящие из полипептидных цепей трех типов. Они явно связываются со специфическими участками и неспецифически разрушают прилегающие к ним участки. Для их действия необходимо наличие АТР, ионов Mg²⁺ и S-аденозилметионина. Уникальная особенность этих белков состоит в способности вызывать гидролиз необычно больших количеств АТР [215]. Значение всех этих свойств рестриктирующих ферментов остается до сих пор неясным. Второй класс рестриктирующих ферментов состоит из относительно небольших мономерных или димерных белков с мол. весом 50 000—100 000. Местом атаки этих ферментов служат, как правило, нуклеотидные последовательности с локальной симметрией второго порядка [217]. Так, например, для двух рестриктирующих эндонуклеаз, детерминируемых ДНК плазмиды R-фактора Е. coli, и рестриктирующего фермента Hemophilus influenzae были идентифицированы следующие участки расщепления (в приведенной ниже схеме стрелками показаны места расщепления, звездочками — места метилирования, а точками — локальная ось симметрии второго порядка):

R-фактор E. coli (Eco RI)

R-фактор E. coli (Eco RII)

H. influenzae (Hind III)

Во многих случаях рестриктирующие ферменты образуют разрывы в каждой из двух цепей в местах, расположенных симметрично относительно оси симметрии второго порядка. Этого и следовало ожидать в случае, если димерный фермент связывается с большой или с малой бороздкой двойной спирали и каждый активный центр взаимодействует с одной из полинуклеотидных цепей.