Пептидная саморегуляция живых систем (факты и гипотезы) - Шатаева Л. К. 2003

Взаимодействия пептидов с клеточной мембраной
Рецепторы плазматической мембраны

Как уже упоминалось, плазматические мембраны представляют собой динамическую структуру, состоящую из липидного бислоя и одноцепочечных мембранных белков, полипептидные цепи которых насквозь прошивают липидный слой. Для совмещения с гидрофобным слоем мембранные белки имеют участки пептидной цепи (домены) с повышенной гидрофобностью боковых групп. Гидрофильные участки этих цепей располагаются на обеих сторонах мембраны. В зависимости от числа трансмембранных доменов и химической ориентации пептидной цепи (от N- к С-концу) различают несколько типов мембранных белков. Тип I имеет один трансмембранный домен, N-конец, экспонированный вовне, и С-конец, расположенный на плазматической стороне мембраны. Тип II тоже имеет один домен и противоположную ориентацию цепи — ее С-конец находится на внешней стороне мембраны. Тип III содержит несколько трансмембранных доменов и внутримембранных петель, при этом оба конца цепи могут оставаться в цитоплазме. Тип IV представляет собой мультимер, т. е. состоит из нескольких субъединиц, трансмембранные домены которых образуют общий трансмембранный канал. Кроме того, некоторые мембранные белки, особенно ферменты, могут быть закреплены на липидном слое мембраны ковалентными связями через гликозилфосфатидилинозитол (GPI-якорь) или другие гликозидные мостики (Oxford Dictionary..., 1997).

Мембранные белки участвуют во всех процессах метаболизма и выполняют защитные функции. Кроме того, определенные белки устанавливают специфические контакты с внешним окружением — со средой и соседними клетками. Эти белки Сингер назвал информационными, так как они формируют и передают сигналы об окружении внутрь клетки (Singer, 1992). Такое подразделение является условным, так как все процессы на поверхности клетки (ферментные, контактные, транспортные, электрохимические) взаимосвязаны и информация о них поступает внутрь клетки.

Ключ к пониманию этой взаимосвязи заключается в структуре мембранных белков. Это одноцепочечные полипептиды, молекулярная масса которых достигает 800 кДа. Весовое соотношение белковых компонентов и липидов в составе большинства плазматических мембран колеблется от 1 : 4 до 4 : 1 в зависимости от ткани и возраста организма (Kamo, 1990). При рассмотрении процессов клеточной саморегуляции участки цепей этих белков, находящиеся на внешней стороне мембраны, называют клеточными рецепторами. На границе раздела “мембрана — внешняя среда” в структуре белка могут также существовать так называемые шарнирные области с высоким содержанием пролина и лейцина, которые позволяют внешней цепи (рецептору) совершать вращательные движения и подстраиваться под положение лигандной молекулы (Кульберг, 1987). При изучении процессов клеточного узнавания и формирования иммунного ответа внешние части мембранных белков, чаще всего гликозилированные, называют маркерами клеточной дифференциации (или клеточными детерминантами) и классифицируют по системе CD (Ярилин, 1999).

Участки цепей мембранных белков, проходящие сквозь фосфолипидный бислой, имеют структуру а-спирали с диаметром 4.6 Å. Шаг спирали составляет 5.4 Å, так что для преодоления толщины фосфолипидного бислоя в 65—70 Å требуется 13—14 витков. Однако это очень приблизительная оценка, так как бислой — динамичная структура. Подвижные фосфолипиды активно подстраиваются к а-спиралям, оптимизируя гидрофобные взаимодействия своих ацильных групп с гидрофобными группами пептидных цепей (Dumas et al., 1999). Длина углеводородной цепи (для разных жирных кислот количество атомов углерода в ней варьирует от 12 до 20) должна соответствовать длине гидрофобного участка а-спирали. Поэтому реальная плазматическая мембрана имеет переменную толщину, зависящую как от структуры мембранного белка, так и от компонентного состава фосфолипидов.

Если внешняя и транслипидная части мембранного белка отвечают за возбуждение и трансляцию информационного сигнала, то внутриклеточная часть пептидной цепи отвечает за адаптационную реакцию клетки. Как правило, внутриклеточная часть мембранного белка, воспринявшая возбуждение от присоединения лиганда к внешнему рецептору, меняет конформацию и степень ассоциированности в системе GTP-связывающего белка, в результате чего происходит дефосфорилирование и начинается каскад адаптивных реакций.

Кроме описанного механизма формирования клеточного ответа существует и другая схема. При осуществлении метаболических и защитных функций рецепторы связывают специфические лиганды (компоненты внешней среды) и затем размешаются в транспортных везикулах, участвуя в процессах эндоцитоза и экзоцитоза (Willeman et al., 1985; Глебов, 1987).

Нужно отметить уникальную способность цитоплазматической мембраны менять свою форму и размеры при формировании эндоцитозных везикул. Внешний слой бислойной мембраны на тех участках, где рецепторы связали внеклеточный материал, сжимается и прогибается внутрь клетки, тогда как внутренний слой фосфолипидов на этом участке растягивается, становится выпуклым и замыкает бислойный пузырек — везикулу. Таким образом, внутренний слой плазматической мембраны становится внешним слоем везикулы, а внешний слой мембраны с ассоциированным внеклеточным материалом оказывается внутренним слоем везикулы. При экзоцитозе комплементарность внешнего и внутреннего слоев фосфолипидной мембраны обеспечивает обратный процесс: прилипание внешнего слоя везикулы к внутреннему слою мембраны, выворачивание везикулы наизнанку и слияние ее фосфолипидного бислоя с цитоплазматической мембраной. При встраивании везикулы в цитоплазматическую мембрану сохраняется компонентный состав внешнего и внутреннего фосфолипидных слоев.

Путем эндоцитоза поглощаются не только специфические рецепторные комплексы, но и трофические полипептиды, которые также стимулируют образование везикул, которые затем транспортируют их в цитоплазму. Этот неспецифический эндоцитоз — один из способов питания клетки (Глебов, 1987).

При эндоцитозе мембранных рецепторов со специфически связанными лигандами лучше всего исследованы процессы образования “одетых” везикул, дополнительно окруженных слоем клатрина. Этот слой формируется около внутренней поверхности плазматической мембраны, окружает бислойную везикулу с мембранными белками и лигандами и транспортируют их к лизосомам или протеосомам, где утилизируются связанные лиганды (Schmid, 1997). Там везикулы разгружаются и возвращаются к внутренней поверхности мембраны. В процессах рециклинга мембранных белков важную роль играет убиквитин — регуляторный пептид, определяющий активность протеосом. В предыдущей главе мы отнесли его к пептидам иммунной системы. В данном разделе следует указать на его активность в процессах специфического эндоцитоза (Strous, Govers, 1999). В следующей главе мы увидим, что убиквитин играет важную роль в структуре хроматина и в регуляции клеточного цикла.

Механизм движения везикул в клетке, очевидно, не диффузионный. Как мы увидим в дальнейшем, внутри живой клетки, как и в отдельных ее органеллах, нет места для диффузионной диссипации энергии. Все движения в клетке управляются межмолекулярными взаимодействиями и локальными электрическими полями. Так организован и трансцитоз — транспорт молекул через клетку. Этот процесс характерен для поляризованных клеток, таких как эпителиальные клетки кишечника, которые имеют базальную и апикальную поверхности (каждая со своим определенным фосфолипидным составом), создающие электрическое поле в клетке и определяющие направление транспорта везикул. Примером может служить адсорбция антител, содержащихся в молоке матери, клетками кишечника новорожденного. Эти антитела поглощаются апикальной поверхностью эндотелиальных клеток, переносятся внутри клетки к базальной поверхности и затем выделяются с базальной поверхности в кровь. Аналогично организован механизм секреции тиреоидного гормона. Сначала тиреоглобулин выделяется в просвет фолликула щитовидной железы, затем происходит эндоцитоз тиреоглобулина эпителиальными клетками, в составе везикул он транспортируется через клетку, одновременно подвергаясь частичному протеолизу, и образованный в везикулах низкомолекулярный гормон тироксин секретируется в ближайший кровеносный капилляр.

В защитных реакциях организма по механизму эндоцитоза значительную роль играют неспецифические рецепторы макрофагов. Макрофаги млекопитающих — наиболее эволюционно древние клетки. На их поверхности имеется не менее 30 типов рецепторов, определяющих поверхность чужеродных клеток или антител, но специфичность этих рецепторов невысока. Предполагается, что в основе распознавания макрофагами чужеродных клеток лежит механизм, сходный с процессом адгезии, реализующийся при участии большого количества низкоаффинных рецепторов. Суммарное сродство с клеткой, с которой связывается макрофаг, определяется спектром рецепторов адгезии на клетке-мишени, их концентрацией и распределением на клеточной поверхности. Этот спектр рецепторов и есть “морфогенетический код” (Зубова, Окулов, 2001). Поглощение инородных частиц по механизму эндоцитоза осуществляется после того, как эти частицы обволакиваются комплементом, и рецепторы макрофагов с высокой селективностью распознают собственный активированный комплемент.

Специфичность мембранного рецептора по отношению к клатриновому эндоцитозу определяется аминокислотной последовательностью в сигнальной части его цепи. Как правило, это 4—5 аминокислотных остатков с характерным алгоритмом последовательности. В частности, активированный рецептор эпидермального фактора роста (EGF) интернализуется в клетку путем эндоцитоза в клатриновых пузырьках. Для этого область связывания EGF имеет сигнальный пептид —F—Y—R—A—L—М—, содержащий характерный для эндоцитозных сигналов тирозиновый мотив: —Y—X—X—L—, где X может быть М, I или F. Предполагается, что специфичность связывания может меняться при замене четвертого и последующих гидрофобных остатков рецептора (Marks et al., 1997).

Большинство из известных мотивов в структуре рецепторов имеют именно такой вид — допустимо произвольное замещение второго и третьего аминокислотных остатков (Owen, Evans, 1998). По-видимому, это связано с плотной упаковкой транслипидных а-спиральных участков пептидной цепи рецепторов, принадлежащих к IV типу трансмембранных белков. Их спиральные блоки плотно прижаты друг к другу в виде жгута для уменьшения поверхности контакта с гидрофобным слоем, а более гидрофильные группы находятся на тех ребрах спирали, которые обращены внутрь жгута. Именно гидрофильные ребра а-спиралей составляют транспортные поры для низкомолекулярных ионов и воды. Как уже упоминалось, в модельных системах использовали каналообразующий пептид из 21 аминокислотного остатка, состоящий из трех повторов а-спирального гептапептида (LSSLLSL)₃. Но для его внедрения в бислойную структуру необходимо присоединение к его N-концу дипептида EW, т. е. фрагмента с ароматической боковой группой (Lear et al., 1997). По-видимому, деструктивное действие пептидных антибиотиков микробного происхождения (тироцидины, грамицидины) на клеточную мембрану также связано с высоким содержанием ароматических аминокислот (Франклин, Сноу, 1984).

Детали структурного взаимодействия рецепторов с пептидными лигандами исследуются с помощью ЯМР-спектроскопии (Pellegrini, Mierke, 1990). Однако особенности нативного строения рецептора в комплексе с лигандом и прилегающими фосфолипидами до сих пор исследованы не полностью. К сожалению, выделение таких мембранных комплексов представляет сложную методическую задачу (Биологические мембраны, 1990). Известно, что при делипидизации многие мембранные белки денатурируют, в частности теряют ферментную активность. Это наблюдалось для ряда мембранных ферментов: Na⁺, K⁺-ATФaзы, глюкозо-6-фосфатазы, галактозилтрансферазы и др. Но при добавлении смеси фосфолипидов их активность восстанавливалась. Кроме того, использование поверхностно активных веществ для солюбилизации мембранных структур может способствовать неспецифическому связыванию компонентов из-за образования тройных комплексов (Кравцов, Алексеенко, 1993).

Особая форма специфической рецепции была обнаружена у гормона роста, ответственного за постнатальный рост и обладающего при этом многими функциями, регулирующими метаболизм. В плазме крови был обнаружен белок, селективно связывающий этот гормон (константа ассоциации К_а порядка 10⁸ л/моль) и не имеющий специального гена. Оказалось, что его структура идентична внешней части мембранного рецептора гормона роста. По-видимому, этот полипептид отщепляется от полной структуры рецептора в результате гидролиза (Baumann, 1993). Так как рецепторы гормона роста имеются у клеток всех тканей растущего организма, остается открытым вопрос о механизме гормональной регуляции в условиях, когда гормон связан со свободно диффундирующей частью рецептора.

Как известно, клетки дифференцированных тканей обладают набором тканеспецифических мембранных белков (рецепторов), отражающих их специализацию. Иными словами, имеется жесткая взаимосвязь между тканеспецифическими функциями клеток и структурной организацией их плазматических мембран. Например, миелин, представляющий собой изоляционную оболочку вокруг аксонов нервных клеток, состоит из уплощенных шванновских клеток. Их плазматические мембраны — возбудимые мембраны — передают электрические импульсы, для чего в них имеются специализированные каналы для ионных потоков. Нервные клетки содержат мембранные “белки возбуждения” — трансмембранные полипептиды, исполняющие функции рецепторов, ионных каналов и ионных насосов. Примером также может служить семейство рецепторов глутамата, т. е. рецепторов “возбуждающих” аминокислот. Различают два типа таких рецепторов: ионотропные, регулирующие проницаемость ионных каналов, и метаботропные, связанные с системой фосфолипидных мессенджеров и ингибированием аденилатциклазы. С фармакологической точки зрения, эти два типа рецепторов различаются чувствительностью к активации специфическими агонистами, например N-метил-сІ-аспартатом. Активированные ионотропные глутамат-рецепторы регулируют проводимость Na⁺, К⁺ и Са⁺⁺, поэтому их называют иногда лиганд-воротным каналом. Обнаружены также вольт-воротные каналы, также представляющие собой мембранные полипептиды, конформация которых определяется мембранным потенциалом.

Особенностью плазматических мембран нервных клеток является то, что в их состав входят полипептиды, не имеющие трансмембранных участков. Примером может служить основной белок миелина, расположенный на внутренней стороне клеточной мембраны, который не имеет сходства со структурами интегральных белков. Он лишен гидрофобных блоков в аминокислотной последовательности, а расположение ионогенных групп вдоль цепи таково, что полипептид приобретает конформацию клубка, который легко меняет свои параметры при взаимодействии с амфифильными пептидами, что может вызвать аллергический энцефалит и дальнейшее развитие демиелинизации (Кагава, 1985).

Ионные компоненты (электролиты), присутствующие в окружающей среде, влияют не только на нервные и мышечные клетки. Концентрации кальция, магния, аммония и ионов водорода определяют конформации многих мембранных рецепторов. Кальций сосредоточен главным образом в костных тканях и не может быть быстро мобилизован для участия в метаболизме. Определенные запасы кальция связаны с гликопротеинами и углеводами в межклеточном пространстве, тогда как внутриклеточная концентрация ионов кальция на несколько порядков ниже концентрации однозарядных ионов. За счет высокого градиента концентрации кальций играет значительную роль в регуляции потенциала и проницаемости плазматических мембран, а при переносе в цитоплазму становится регулятором активности вторичных мессенджеров — диацилглицерина и инозит-трифосфата (Левицкий, 1990). Механизм его регуляторной функции заключается в том, что при связывании с пептидной цепью кальций существенно меняет ее конформацию. Селективным носителями кальция являются кальмодулин и тропонин Т, которые связывают по 4 атома Са.

Среди низкомолекулярных модуляторов конформаций клеточных рецепторов первое место принадлежит ионам водорода, так как в физиологических условиях незначительное изменение кислотности может на два порядка изменить степень ионизации боковых групп пептида.

В частности, сравнительно недавно было найдено, что направленный транспорт воды в живую клетку осуществляется с помощью специальных трансмембранных белков — аквапоринов (Lieburg, 1995). К настоящему времени охарактеризовано более десятка представителей этого класса мембранных белков. Они все имеют по 6—8 трансмембранных а-спиральных участков и обладают значительной гомологичностью этих структур. Белок аквапорин 0 относится к классу самых эволюционно консервативных белков и найден в составе различных тканей (Nemeth-Cahalan, Hall, 2000). При исследовании набухания ооцитов было установлено, что понижение pH внешнего раствора от 7.2 до 6.5 увеличивает проницаемость клеточных мембран для воды в 3-4 раза. Изучение этого эффекта при вариации аминокислотных остатков в полипептидной цепи аквопорина 0 показало, что pH-регуляция водного потока в клетку осуществляется всего одним аминокислотным остатком His⁴⁰, расположенным на внешнем участке белка, имеющего в составе 263 аминокислотных остатка. Значение рК_а гистидила находится в области pH 7.0. Снижение pH внешнего раствора до 6.5 приводит к протонированию имидазольного кольца и соответствующему переходу его гидратации от клатратной к гидратной. Это открывает канал для интенсивного транспорта воды внутрь клетки. В предпоследнем столбце табл. 1 (см. главу 1) представлены значения гидрофобности для аминокислотных остатков в деионизированном состоянии. Протонирование кольца гистидила и его переход в состояние гидрофильного остатка сопровождаются соответствующим изменением его гидрофобности от —1 до -7 кДж/моль, что превышает энергию гидролиза АТФ до АДФ.

Другой пример относится к аквапорину 1. Этот мембранный тетраметр принадлежит к IV типу трансмембранных белков и отвечает за поддержание оптимальной концентрации воды в клетке. Домены аквапорина 1 образуют в мембране высоко специфические каналы для воды, которые не пропускают даже ионы водорода и гидроксила, не говоря уже о других электролитах. При исследовании аминокислотной последовательности аквапорина 1 была проведена количественная оценка гидрофобности его трансмембранных доменов и рассчитано уменьшение конформационной энтропии этих доменов при переходе от вытянутой пептидной цепи к а-спирали, погруженной в липидный бислой. Энтропийная составляющая уменьшения свободной энергии составила 83 кДж/моль. Расчеты показали, что это соответствует среднему увеличению молекулярной информации за счет гидрофобных взаимодействий (без учета статистики распределения аминокислотных остатков) на 0.6 бит/a. о., или в среднем на 15 бит на один трансмембранный домен (Neuman, Engel, 2000).

Значительный запас конформационной энергии спиральной пептидной цепи рецептора в липидной мембране объясняет молекулярный механизм усиления сигнала после взаимодействия рецептора с лигандом. Поскольку при этой конформации все торсионные углы цепи жестко связаны друг с другом, даже небольшое изменение поворота или гидратации одного аминокислотного остатка из-за взаимодействия с лигандом приводит к согласованному, т. е. кооперативному, изменению конформации всей цепи. Поэтому воспринятый клеткой (или соседними рецепторами) сигнал будет многократно усилен за счет кооперативного увеличения свободной энергии пептидной цепи рецептора.

Среди всех перечисленных выше особенностей белков цитоплазматической мембраны самой главной является их структурная комплементарность с углеводородными цепями фосфолипидов на тех участках, которые “прошивают” мембрану. Поэтому конформационные переходы на этих участках и их энергия должны рассматриваться в совокупности с изменениями жидкокристаллической структуры прилегающего липидного бислоя.