Фармакогнозія з основами біохімії рослин - Ковальов В. М. 2004

Спеціальна частина
Пептиди та білки

Пептиди, поліпептиди, пептони — речовини, молекули яких складаються із залишків а-амінокислот, поєднаних між собою пептидними зв’язками —С(О)—NH—.

Білки — високомолекулярні природні органічні речовики, які також складаються з амінокислот, і є основою структури й функції живих організмів.

Будова та класифікація пептидів та білків

Пептидний зв’язок утворюється в процесі приєднання карбоксильної групи (—СООН) однієї амінокислоти до аміногрупи (—NH₂) другої амінокислоти шляхом дегідратації. Залежно від кількості залишків амінокислот, що входять до складу пептиду, розрізняють дипептиди, трипептиди і т. ін. Поліпептиди, які містять від 2 до 10 амінокислотних залишків, називають олігопептидами, понад 10 — поліпептидами.

Умовно вважають, що пептиди містять до 100, а білки понад 100 амінокислотних залишків. Це відповідає молекулярній масі пептидів, яка становить до 10 тис.; білки мають молекулярну масу від 10 тис. до 1 млн і навіть вище.

Для високомолекулярних пептидів і білків характерні чотири рівні структурної організації молекули. Природа амінокислотних залишків і порядок їх поєднання — це первинна структура. Вона, в свою чергу, зумовлює формування більш високоорганізованих структур. Вторинна структура — це конфігурація поліпептидного ланцюга з утворенням найчастіше а-спіралі або ß-структури. Вторинна структура стабілізується водневими зв’язками між пептидними групами, які близько розташовані в ланцюзі залишків амінокислот. Третинна структура є просторовою орієнтацією вторинної структури. Ця структура закріплюється не тільки водневими зв’язками, а й іншими видами взаємодії, наприклад іонними, гідрофобними й дисульфідними. Перші три рівні структурної організації характерні для всіх білкових молекул. Четвертинна структура відноситься до макромолекул, які складаються з декількох поліпептидних ланцюгів (субодиниць), не зв’язаних ковалентно. Четвертий рівень характеризує поєднання й розташування цих субодиниць у просторі.

Пептиди містяться в усіх видах організмів. У чистому вигляді олігопептиди звичайно є кристалічними речовинами і при нагріванні до 200-300 °С вони розпадаються. Добре розчинні у воді, розведених кислотах і лугах, практично нерозчинні в органічних розчинниках, за винятком тих, що побудовані із залишків гідрофобних амінокислот. Олігопептиди за своїми властивостями ближчі до амінокислот, а поліпептиди — до білків.

У живих організмах пептиди можуть знаходитися у вільному стані, наприклад глутатіон, карнозин. Багато з них мають специфічну біологічну активність. Серед пептидів є гормони, антибіотики, вітаміни, токсини, інгібітори, активатори ферментів та їхні похідні. У лабораторних умовах пептиди одержують неповним гідролізом білків, а фізіологічно активні синтезують з амінокислот.

Більшість білків має такий елементний склад: 50,6-54,5 % вуглецю, 6,5-7,3 водню, 21,5-23,5 кисню, 15-17,6 азоту, 0,32,5 % сірки; до складу багатьох білків входять ще фосфор, залізо, цинк. Практично всі білки складаються з амінокислот, які, за винятком гліцину, належать до L-ряду. Пептиди, на відміну від білків, мають більш різноманітний амінокислотний склад і часто включають залишки амінокислот D-ряду, а також містять у своїй структурі циклічні фрагменти і розгалужені ланцюги. Молекули білків не проходять крізь напівпроникні мембрани, у них слабка здатність до дифузії. Білки — амфотерні електроліти, мають вільні карбоксильні (кислотні) й амідні (лужні) групи. Розчинність білків дуже відмінна. Розчини білків у воді — гідрофільні колоїди, їм властива значна в’язкість і низький осмотичний тиск. Багато білків здатні кристалізуватися.

Детальна хімічна будова білків ще не вивчена, тому їх поділяють за хімічним складом на прості і складні. Прості білки — протеїни (альбуміни, глобуліни, гістони, глутеліни, проламіни, протаміни, протеноїди) складаються тільки з амінокислот. Складні (протеїди), крім білкової частини, містять небілковий компонент, так звану простетичну групу. Складні білки включають такі типи: глікопротеїни, що містять вуглеводи; ліпопротеїни, що містять ліпіди; хромопротеїди, що містять пігменти; фосфопротеїни, що містять фосфорну кислоту; нуклеопротеїни, що містять нуклеїнові кислоти; металопротеїни, що містять метали.

За просторовою формою білки поділяють на глобулярні й фібрилярні. Глобулярні білки характерніші для рослин. Вони мають а-спіральну структуру і їм властива форма сфери. Прикладом глобулярного білка є альбумін (яєчний білок). Майже всі ферменти належать до глобулярних білків. Фібрилярні білки поширені в тваринних організмах. Для них характерна ß-структура і волокниста будова. До цієї групи належить ß-кератин (є основою волосся, рогової тканини), колаген (сполучна тканина). Глобулярні білки добре розчиняються у воді й соляних розчинах з утворенням колоїдів; фібрилярні — не розчиняються у воді.

Біологічні функції білків у рослинах і тваринах

Білки є вирішальним фактором активних проявів життєдіяльності, біологічною формою руху матерії. Різноманіття будови, точність унікальної організації поєднуються в білках із пластичністю. Усе це створює значні функціональні можливості. За біологічними функціями білки поділяються на:

ферменти — високоспецифічні каталізатори біохімічних реакцій; структурні білки — основа кісткової й сполучної тканини, вовни тощо (наприклад, колаген);

регуляторні білки — ті, що контролюють біосинтез білків і нуклеїнових кислот, а також гормони;

рецепторні білки — розташовані на зовнішній поверхні плазматичних мембран і приймають інформацію про стан навколишнього середовища;

транспортні, або білки-переносники,— беруть участь в активному транспортуванні іонів, ліпідів, сахарів та амінокислот крізь біологічні мембрани; це також гемоглобін і міоглобін, які переносять кисень;

біоенергетичні, або білки біоенергетичної системи,— перетворюють і утилізують енергію з продуктів харчування та сонячного випромінювання (наприклад, родопсин, цитохроми);

харчові й запасні — відіграють важливу роль у розвитку та функціонуванні організму;

захисні — є захисними системами вищих організмів; це імуноглобуліни (відповідальні за імунітет), білки комплементу (відповідальні за лізис чужорідних клітин і активізацію імунологічних функцій), білки системи зсідання крові (тромбін, фібрин) та противірусний інтерферон.

Методи виділення та дослідження білків

Першим етапом виділення білків є одержання відповідних органел (рибосом, мітохондрій, ядер, цитоплазматичної мембрани тощо) за допомогою диференційного центрифугування. Далі білки переводять у розчинний стан екстракцією буферними розчинами солей або детергентів, іноді неполярними розчинниками. Для запобігання денатурації білків роботу звичайно проводять при температурі близько 4 °С. З метою виключення протеолізу використовують інгібітори протеаз. Деякі білки стабілізують поліолами, наприклад гліцерином. Надалі використовують фракційне осадження неорганічними солями (звичайно амонію сульфатом), етанолом, ацетоном або зміненням pH, іонної сили, температури розчину. Очищення проводять за схемами, спеціально розробленими для окремих білків. Найпоширеніші методи розподілу суміші білків — це гель-хроматографія, іонна, адсорбційна, афінна хроматографія та високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ). Критерієм чистоти білків є їхня гомогенність при електрофорезі, хроматографуванні та ультрацентрифугуванні. Для виявлення домішок інших білків (до 10³ мкг/мл домішки антигену) використовують високочутливі імунохімічні методи. Домішки супутніх ферментів визначають за допомогою спеціальних субстратів.

Встановлення структури. Знання первинної структури білка — основа для визначення його вторинної й третинної структури, з’ясування розташування функціональних груп в активному центрі білка і для побудови моделі його функціонування. Для білків визначають амінокислотний склад поліпептидних ланцюгів, N- і С- кінцеві амінокислотні залишки, амінокислотну послідовність. Аналіз амінокислотного складу включає повний гідроліз білка або пептиду й кількісне визначення всіх амінокислот у гідролізаті. Таке визначення проводять за допомогою амінокислотного аналізатора, де суміш амінокислот розподіляють на іонообмінних колонках, а вміст оцінюють спектрофотометрично за реакцією з нінгідрином або флуориметрично. Важливим етапом у визначенні первинної структури є розщеплення макромолекули на пептидні фрагменти з використанням протеолітичних ферментів або хімічних реагентів, які мають субстратну специфічність. Наприклад, трипсин гідролізує тільки зв’язки, в яких бере участь карбоксильна група лізину або аргініну. У ряді випадків для розщеплення білків використовують метод часткового кислотного гідролізу. Далі одержані пептиди поділяють за їх фізико-хімічними властивостями та довжиною молекул. Для фракціонування коротких пептидів (до 15-20 амінокислотних залишків) використовують іонообмінну хроматографію на катіонітах. Подальший розподіл і очищення

проводять з використанням хроматографії та електрофорезу на папері або в тонкому шарі целюлози, силікагелю. Основна складність при фракціонуванні великих пептидів (більш як 20 амінокислотних залишків) — їхня властивість утворювати високомолекулярні агрегати. Для запобігання цьому в буферні розчини додають сечовину, гуанідиній-хлорид або детергенти. Розподіл часто проводять за допомогою гель- або іонообмінної хроматографії, рідше — ВЕРХ. Ковалентна хроматографія, основана на утворенні ковалентного зв’язку пептиду з носієм, використовується для пептидів з хімічно активними групами.

Для безпосереднього аналізу первинної структури звичайно використовують секвенатор — прилад, який здійснює послідовне автоматичне відщеплення та аналіз N-кінцевих амінокислотних залишків. При визначенні амінокислотної послідовності пептидів іноді застосовують мас-спектрометрію. У деяких випадках використовують швидкий і ефективний метод аналізу нуклеотидної послідовності ДНК, оскільки первинна структура будь-якого білка закодована у відповідній ланці молекули ДНК.

Для встановлення просторової структури білка використовують різноманітні сучасні методи аналізу, такі як рентгено-структурний аналіз, нейтронографію, УФ-, 14-, ЯМР- та ЕПР- спектроскопію. При цьому досліджують білок нативний або модифікований різноманітними реактивами, що несуть вільний радикал («спінова мітка»). Теоретично, виходячи з первинної структури білка, можна передбачити в загальному вигляді його просторову будову. Такого роду розрахунки проводять за допомогою програм ЕОМ на основі закономірностей, виведених при статистичній обробці даних для білків із встановленою просторовою структурою. У ряді випадків такі розрахункові методи дають задовільні результати, які допомагають інтерпретувати дані, отримані іншими методами.