Химия белка. Структура, свойства, методы исследования - Шендрик А.Н. 2022

Методы экспериментального исследования структуры белков
Хроматография
Метод газо-жидкостной хроматографии

Метод газожидкостной хроматографии (ГЖХ) - это один из наиболее развитых, доступных и эффективных методов хроматографии. Неподвижная фаза в ГЖХ - твердый гранулированный пористый носитель, пропитанный жидким сорбентом. Поэтому, для реализации газожидкостной хроматографии необходимы три компонента: твердый носитель, жидкая неподвижная фаза, и газовая подвижная фаза - элюэнт.

Твердый носитель

В качестве носителей для насадочных колонок в методе ГЖХ используют специально приготовленные диатомитовые земли. Поверхность этих материалов можно модифицировать различными способами. Наилучший результат дает промывка сильными минеральными кислотами для удаления ионов металлов, и последующая дезактивация поверхности силанизирующими реагентами. После такой обработки поверхность носителя химически более инертна, чем у исходного материала. В настоящее время ассортимент выпускаемых промышленностью твердых носителей для ГЖХ достаточно велик и обеспечивает практически любые запросы исследовательских лабораторий. Для анализа биологических материалов используют чаще всего различные хромособры (хромосорб W, например).

Неподвижная фаза

В принципе, неподвижной фазой в методе ГЖХ может служить практически любое вещество, которое можно закрепить на носителе, и которое имеет низкую упругость паров при температуре проведения анализа. Ассортимент выпускаемых промышленностью веществ для неподвижных фаз просто огромен. В серийных биологических исследованиях находят применение чаще всего силиконы (серии ХЕ - ХЕ-30, ХЕ-60, например) - относительно неполярные жидкие фазы. Полиэфиры (например БДС - бутандиол-1,4-сукцинат, НПГГ - неопентилгликольглутарат, ЭГА - этиленгликольадипинат, ПЭГА - полиэтиленгликольадипинат и многие др.) По полярности полиэфиры располагаются между силиконами и полигликолями. Последние представляют собой достаточно полярные неподвижные фазы. Кроме того можно использовать различные поверхностно-активные, металлоорганические и другие соединения.

В качестве неподвижной жидкой фазы в ГЖХ нередко используют и смеси различных веществ.

Подвижная фаза

Подвижная фаза в ГЖХ - это, как правило, инертный газ (азот, гелий, водород, аргон). В специальных целях могут использоваться и другие газы или пары веществ (вода, аммиак и др.).

Основные понятия

> Хроматографическая кривая (хроматографический пик) - кривая зависимости концентрации (или какого-либо пропорционального концентрации параметра) на выходе из колонки от времени с момента ввода пробы, или объема прошедшего через колонку элюэнта. Идеальный хроматографический пик должен иметь форму правильной гауссовой кривой (равнобедренный треугольник). На практике, однако, форма пика часто искажена либо по его фронту, либо по тылу (так называемое размывание пика). Причины размывания пика весьма разнообразны. Мы на них останавливаться не будем.

> Время удерживания (t_R - время между вводом пробы и выходом максимума концентрации компонента из колонки.

> Время задержки газа (t_m) - время удерживания абсолютно инертного (не удерживаемого неподвижной фазой) вещества. Подобрать такое вещество иногда очень трудно. Чаще всего таким веществом служит воздух (если детектор - катарометр) или метан (если детектор по ионизации в пламени).

> Ширина хроматографического пика (ω) - длина сегмента, измеренная между точками пересечения нулевой линии с касательными, проведенных к точкам перегиба восходящей и нисходящей ветвей хроматографического пика. Ширину пика характеризуют нередко длиной отрезка, проведенного параллельно нулевой линии между точками восходящей и нисходящей ветвями пика на половине его высоты.

> Высота пика (h) - расстояние от нулевой линии до т. максимума хроматографической кривой.

> Площадь пика - площадь заключенная между хроматографической кривой и нулевой линией. Определяют величину этой площадь различными способами. Рассчитывают по формуле площади треугольника (если пик правильный), разбивают на мелкие квадраты или прямоугольники, вырезают нанесенные на бумагу пики и взвешивают и т.д. Современные хроматографы снабжены, как правило, электронными интеграторами, которые ведут расчет площадей автоматически. Смысл перечисленных параметров проиллюстрирован на рис. ниже:

Параметры удерживания вещества

> Приведенное время удерживания (t'_R) - время удерживания компонента за вычетом времени задержки газа (см.рис.):

t'_R - t_R - t_m

Величины t_R и t'_R сильно зависят от условий и режима хроматографирования, поэтому они редко используются для характеристики удерживания вещества неподвижной фазой. Менее чувствительными к условиям анализа являются объемы удерживания.

> Удельный объем удерживания (V_r) - произведение времени удерживания на объемную скорость (v) потока подвижной фазы (газа-носителя) на выходе из колонки:

V_R = t_RV

> Мертвый объем (V_m) - объем удерживания не адсорбирующегося на неподвижной фазе абсолютно инертного вещества:

V_m = t_RV

> Приведенный объем удерживания (V’_R) - разность объемов V_R и V_m:

> Исправленный объем удерживания (V_N). Величина V_R зависит от скорости потока подвижной фазы. В ГЖХ это учитывают через коэффициенты Джеймса-Мартина (j)

V_n = jV_R

> Коэффициент емкости колонки (к’) определяется соотношением:

k' = (t_R - t_m)/t_m

Параметры, характеризующие разделение двух веществ

У Относительное удерживание (а) веществ 1 и 2 есть по определению одно из следующих отношений:

а = (t'_R)₂(t'_R)₁ = k₂’/k₁’ = (V_R')₂/(V_R')₁

Величина а зависит от типа неподвижной фазы и температуры. Мало зависит от природы, скорости потока и давления газа-носителя.

> Индекс удерживания Ковача (I). Один из наиболее важных для практики параметров удерживания. Введен Ковачем. Из-за наглядности, простоты определения и незначительной чувствительности к условиям анализа эти индексы табулированы для многих веществ и неподвижных фаз. Индекс I определяется по отношению к двум стандартным нормальным алканам (1 и 2), между пиками которых расположен пик анализируемого вещества (см. рис.)

Величина I_х для вещества (X), пик которого расположен между пиками двух нормальных алканов (1 и 2) (см. рис.) вычисляется по формуле:

где Z - число атомов углерода в первом алкане.

Помимо индексов Ковача, в практику ГЖХ пытались вводить и более сложные индексы, рассчитываемые на основе времен удерживания от 3 до 10 реперных соединений. Они более точны, однако требуют больших затрат на их определение и широкого распространения не получили.

Степень разделения. Степень разделения двух соседних пиков на хроматограмме оценивают уравнением:

При количественном анализе степень разделения должна быть не менее 1.5. Если высоты двух соседних пиков существенно различны, то ∆_1,2 должна быть еще больше.