Химия белка. Структура, свойства, методы исследования - Шендрик А.Н. 2022

Методы экспериментального исследования структуры белков
Хроматография
Ионообменная хроматография

Основы принципа ионного обмена заложил русский ботаник-физиолог и биохимик Михаил Семенович Цвет. В 1910 г. им опубликованы теоретические основы метода ионного обмена. В 1948 г. американские ученые Мур и Стейн разработали теорию ионообменной хроматографии в приложении к фракционированию сложных смесей аминокислот и внедрили ее в практику. В этом методе использованы ионообменные полимеры (ионообменные смолы). В качестве таковых применяют синтетические полистирольные полимеры, цепи в которых сшиты дивинилбензолом, или природные полимеры на основе целлюлозы или сефадекса. Сефадекс - это природный полимер декстран, который является полисахаридом (полимером глюкозы) с ММ от 12млн до 1 млрд. и вырабатывается особыми бактериями. Сефадексы получают в виде гранул после сшивания эпихлоргидрином (ЭХГ) длинных нитей декстрана поперечными связями. В зависимости от количества введенного ЭХГ (соответственно числа поперечных сшивок) получают сефадексы с различными размерами ячеек (пор) молекулярных сит. В зависимости от величин пор через них могут проникать белки с определенными ММ. Например, сефадексы: Г-25 до 400; Г-50 до 10 000; Г-75 до 50 000; Г-100 до 100 000; Г-200 до 200 000.

Все вышеназванные полимеры после модификации содержат на своей поверхности способные к диссоциации ионогенные группы, которые могут обмениваться ионами с соответствующими группами аминокислот или белков. Ионообменные смолы подразделяются на два больших класса: катиониты (катионообменники) и аниониты (анионообменники).

Катионообменные смолы содержат на поверхности такие группы:

• -SO3^--M⁺, -РО₃^2- -М⁺, AsO₃^2- -M⁺ - сильные катионообменники.

• -СОО^- -М⁺ - слабый катионообменник.

Анионообменники:

• -N⁺R₃/A^-, -C₅N⁺/A^- - сильные

• -N⁺H₃/A^-, -N⁺H₂R/A^-, -N⁺HR₂/A^- - слабые

М⁺, А^- - участвующие в ионном обмене катион и анион смолы соответственно.

Синтетические ионообменники применяют чаще для анализа смесей аминокислот. Белки разделять с их помощью тяжело по следующим причинам.

1. Они имеют низкую емкость в отношении белков. Это связано с наличием в полимерной сетки смолы большого числа сшивок из-за чего молекулы белков не могут проникать внутрь ионообменника, а взаимодействуют только с его поверхностью.

2. Эти смолы содержат большое число ионогенных групп (примерно через каждые 10Å). В результате белок прочно удерживается смолой и его трудно вытеснить элюэнтом. Значительно лучшими смолами для белков являются природные ионообменники, в которых намного меньше сшивок, а ионогенные группы расположены с интервалом =50 Å.

Хорошими ионообменниками для анализа белков являются.

> Карбоксиметилцеллюлоза (КМ-целлюлоза). Часть гидроксильных групп целлюлозы замещены в этом катионите на группы -ОСН₂СООН, которые после обработки щелочью переходят в солевую форму -ОСН₂СООNa. Слабый катионит, обменивает катион натрия.

> Сульфоэтилцеллюлоза (SE-целлюлоза) содержит группу - OCH₂CH₂SO₃H(Na) - сильный катионообменник.

> Диэтиламиноцеллюлоза (ДЭАЭ-целлюлоза) - один из эффективных для анализа белков анионообменник. Часть гидроксильных групп в ней заменена на группы -OCH₂CH₂-N(C₂H₅)₂. Их переводят в ОН^- или Cl^- - формы:

[OCH₂CH₂-N⁺H(C₂H₅)₂]•OH^-, [OC₂C₂-N+H(C₂H₅)₂]•Cl^-.

Анионообменники более эффективны для разделения кислых и нейтральных белков, катионообменники - для разделения основных белков.