Химия белка. Структура, свойства, методы исследования - Шендрик А.Н. 2022

Методы экспериментального исследования структуры белков
Электронная микроскопия

В настоящее время есть два метода непосредственного исследования структуры белков в твердом состоянии - это методы электронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа. Остановимся вкратце на них.

Невооруженный глаз человека способен в норме различить две точки, если расстояние между ними составляет около 0.1 мм (100 мкм). При меньших расстояниях разделенные в пространстве объекты воспринимаются глазом как непрерывные, слитые в один.

Оптические микроскопы имеют теоретический предел разрешения около 2000 Å. Этот предел обусловлен тем, что микроскоп любой конструкции (в идеале, при идеальных линзах) способен различить две точки расстояние между которыми не менее 1/2 длины волны используемого для освещения объекта света. Таковы законы оптики. Если, например, мы используем видимую область оптического спектра (= 5000Å, 0.5мкм), то теоретическая граница разрешающей способности оптического микроскопа не может быть меньше 2500Å (0.25мкм). Использование УФ света и специальных кварцевых линз позволяет повысить разрешение до 0.17мкм. Оптические микроскопы позволяют наблюдать интактные клетки диаметром 1-20 мкм, однако они явно непригодны для того, чтобы увидеть отдельные молекулы белка. Значительно большие разрешающие возможности достигнуты в электронных микроскопах.

По принципу действия электронный микроскоп ничем не отличается от оптического. В нем только в качестве источника облучения использован поток электронов высокой энергии, а вместо вещественных (стеклянных) линз - электромагнитные катушки фокусировки (электромагнитные линзы).

Оценим теоретический предел разрешающей способности электронного микроскопа. Согласно де’Бройлю энергия движущейся вещественной частицы и ее длинна волны связаны соотношением:

λ = h/m_eV

где m_e и V - масса и скорость движения электрона соответственно. Если электрон ускоряется в поле с разностью потенциалов, равной U, то его кинетическая энергия определяется как:

m_eV²/2 = eU

где е - элементарный заряд электрона.

Заменив фундаментальные константы их числовыми значениями, получим для длинны волны ускоренного электрона следующее простое соотношение:

λ = 12.3/U^1/2(ß)

При U = 50000В (50кВ) λ = 0.05Å, т.е. разрешающая способность составит около 0.025Å (0.0000025мкм). Это очень высокое разрешение, которое достаточно для того, чтобы наблюдать отдельные атомы водорода. На практике из-за неоднородности фокусирующих полей и ряда других причин ее достичь не удается. Лучшие современные электронные микроскопы обеспечивают разрешение около 2А (0.0002мкм), что позволяет исследовать, не только строение клеток, но и наблюдать отдельные крупные макромолекулы. Принцип действия современного электронного микроскопа и его внешний вид приведены на рисунке 4.13.

Рис. 4.13 Внешний вид и схема, иллюстрирующая принцип действия, электронного микроскопа

Электроны, прошедшие через образец, формируют его изображение, которое регистрируют на специальной фотопленке и получают электронную микрофотографию образца (объекта). В электронной микроскопии контрастность изображения определяется распределением плотности массы в образце. Молекулы белка не обладают достаточной контрастностью, поэтому образцы “окрашивают” обработкой электронноплотными веществами - солями вольфрама, осмия или платины.

Исследуемый образец в электронном микроскопе помещают на тонкую угольную пленку, нанесенную на круглую мелкоячеистую медную сеточку диаметром около 3 мм: (см. фрагмент на рис. 4.14).

Рис. 4.14 Держатель образца электронного микроскопа (сетка): фрагмент, вид сверху (А) и сбоку (Б).

1 - углеродная пленка - подложка; 2 - образец; 3 - металлическая сетка