Химия белка. Структура, свойства, методы исследования - Шендрик А.Н. 2022

Методы экспериментального исследования структуры белков
Размер и форма белковых молекул

Существует много методов и приемов, позволяющих установить форму и размеры белковых молекул. Однако получаемая с их помощью информация различна как по степени надежности, так и по степени разрешения структуры макромолекул.

Наиболее точные данные о величине, форме, конформации белковой молекулы можно получить только с помощью метода рентгеноструктурного анализа (РСА). Практические трудности использования этого метода для исследования биологических объектов и высокая стоимость необходимого оборудования, однако, таковы, что метод РСА доступен далеко не каждой научной лаборатории и число исследованных с его помощью белков пока весьма ограниченно, хотя в последние годы и растет очень быстро. Основное ограничение - это необходимость иметь белок в твердом кристаллическом состоянии. Для большинства же белков сведения об их структуре получены с помощью менее совершенных и более простых физико-химических методов, позволяющих выполнять анализ в растворах. Эти методы позволяют определить основные физико-химические параметры макромолекул, и уже на основании этих характеристик делать определенные заключения о форме и размерах белковых молекул. В число этих параметров входят:

> молекулярная гомогенность,

> молекулярная масса,

> коэффициент диффузии,

> вязкость растворов белков

Молекулярная гомогенность характеризует число и относительное содержание различных видов белковых молекул в исследуемом образце. Методы, которые позволяют получить такую информацию основаны на законах движения частиц в растворах, помещенных в гравитационные (седиментация, ультрацентрифугирование) или электрическое (электрофорез) поля с высокой напряженностью.

Молекулярная масса (ММ) белковой молекулы может быть определена с различной точностью, разными методами. Основное, при определении ММ - это получение чистого гомогенного образца белка. Кроме того, важными параметрами при определении ММ являются: заряд молекулы, ее форма и степень гидратации. Так например, при измерениях скорости движения частицы надежные результаты получаются только для тех молекул, форма которых близка к сферической, т.е. для глобулярных белков. Отклонение от сферической формы (фибриллярные белки) и гидратация приводит к различным погрешностям из-за увеличения коэффициента трения при движении молекул в растворе или возрастания их эффективного размера. В тех случаях, когда белок не является монодисперсным, результаты измерений усредняются (см. среднечисленная и средневесовая ММ.)

Коэффициент диффузии (D) является одним из тех параметров, которые достаточно отчетливо “реагируют” на форму белковой молекулы. Однако, только на основании величины D можно сделать лишь весьма приближенные заключения о размерах и форме молекул. Чаще, если известна ММ, вычисляют величину так называемого фрикционного отношения (f/f₀). Здесь - f- экспериментально измеренная величина коэффициента трения, f₀ - идеальный коэффициент трения - величина коэффициента f для негидратированных молекул той же массы, что и белок, с идеальной сферической формой. Чем больше величина фрикционного отношения отклоняется от единицы, тем более “вытянутую” форму имеет молекула белка. Никакой другой (более определенной) информации о форме белковой молекулы значение фрикционного отношения не несет, хотя в ряду белков она и может быть довольно наглядной относительной характеристикой отклонения формы от сферической (см.табл. 4.1)

Таблица 4.1 Физические константы некоторых белков

Вязкость раствора является, по-видимому, самой простой мерой асимметрии растворенных макромолекул. Вязкость белковых растворов определяют, как правило, методом вискозиметрии. Его суть состоит в измерении скорости истечения раствора из капилляра под действием силы тяжести и сравнении этой скорости со скоростью истечения чистого растворителя в тех же условиях. По увеличению времени истечения белкового раствора судят о его характеристической вязкости. Характеристическая вязкость белкового раствора сравнительно невелика, если его молекулы имеют сферическую форму. Она заметно возрастает при переходе к элипсоидным и особенно палочковидным формам при той же ММ белковых молекул их концентрации в растворе. Поэтому, измерения вязкости широко используется для обнаружения изменений в форме молекул. Установлено, например, что при взаимодействии выделенного из мышц белкового комплекса актомиозина с АТР вязкость раствора уменьшается. Обусловлено это тем, что в присутствии АТР молекулы актомиозина, имеющие форму палочек, диссоциируют на актин и миозин. Молекулы последних имеют элипсоидную форму с меньшей величиной отношения осей.

Таким образом, косвенно, методами физико-химического анализа, при исследовании белковых растворов можно лишь с большей или меньшей степенью вероятности установить какой из идеальных форм (сфера, цилиндр, элипсоид вращения и т.д.) наиболее близка форма молекулы белка. В заключении о форме белковой молекулы всегда должна содержаться информация о происхождении белка, его лабильности. Не исключено, что по ходу анализа форма молекулы может претерпевать большие или меньшие изменения. Белок может изменяться и в процессе его выделения, очистки. Учесть все это крайне сложно. Поэтому всегда следует формулировать окончательные выводы о форме белковой молекулы с некоторой осторожностью.

Не менее актуальным остается по сей день вопрос о том, насколько сильно отличаются между собой белки в растворе и в кристаллическом состоянии. На то, что такие различия, вероятно, есть указывают результаты экспериментальных исследований некоторых белков.