Химия белка. Структура, свойства, методы исследования - Шендрик А.Н. 2022

Методы экспериментального исследования структуры белков
Методы определения молекулярной массы белков
Определение молекулярной массы методом светорассеяния

Если пропустить луч света через белковый раствор в затемненной комнате, то его путь через сосуд становится видимым. Это свойство коллоидных растворов хорошо изучено и известно как опалесценция. Явление опалесценции обусловлено рассеянием света, а сам эффект назван эффектом Тиндаля.

Если известны длина волны падающего света, интенсивность рассеянного излучения, показатели преломления растворителя, а также показатель преломления и концентрация растворенного вещества, то можно рассчитать его молекулярную массу.

Существует два методических подхода. Первый используют, если размер растворенных молекул в 10-20 раз меньше длины волны облучающего света. В этом случае молекула выступает как один рассеивающий излучение центр.

Второй подход применяется когда длина волны излучения сравнима с размером молекул или больше. Тогда, в одной и той же молекуле может быть несколько независимых осцилляторов и необходимо учитывать интерференцию световых лучей рассеянных различными участками одной и той же молекулы (см рис.).

Для первого случая применимо уравнение Релея для зависимости интенсивности рассеянного под углом 0 света от расстояния до рассеивающей частицы:

где R₀ - приведенная интенсивность или число Релея;

I₀,I₀ - интенсивность падающего и рассеянного света соответственно;

r - расстояние от рассеивающей частицы до приемника света.

Для идеальных разбавленных растворов величина R₀ пропорциональна ММ растворенного вещества (М) и его весовой концентрации (с):

R₀ = KMc

Коэффициент пропорциональности (К) является функцией, имеющей вид:

где n₀, n - показатель преломления растворителя и раствора соответственно; N - число Авогадро.

Величины R_θ, n₀, dn/dc определяют экспериментально и подстановкой в уравнение рассчитывают молекулярную массу белка.

Для неидеальных растворов пользуются эмпирическим соотношением:

где В - эмпирическая постоянная, и строят зависимость в координатах:

Отсекаемый на оси ординат отрезок равен обратной величине молекулярной массы (см. уравнение, рисунок).

Если размеры молекул белка соизмеримы с X, то в уравнение вносятся дополнительные поправки:

где R²_G - так называемый радиус инерции.

Для различных форм белковых молекул (сфера, цилиндр, клубок и т.д.) существуют специальные формулы для расчета величин R²_G. Если при подстановке рассчитанного для определенной формы молекулы значения R²_Gв уравнение экспериментальные данные укладываются на прямую в координатах:

то считают, что форма молекулы, и соответственно R²_G, выбраны верно.

Рассеяние света уменьшает интенсивность излучения прошедшего через раствор. Для растворов с размером частиц значительно меньше длинны падающего света выполняется соотношение аналогичное закону Ламберта-Бугера-Бера:

где т - мутность.

Величину т измеряют с помощью нефелометров.