Химия белка. Структура, свойства, методы исследования - Шендрик А.Н. 2022

Методы экспериментального исследования структуры белков
Методы разделения белков
Экспериментальные методы электрофореза

Существует три основных разновидности ЭФ:

> фронтальный;

> зональный;

> стационарный.

При фронтальном ЭФ электрическое поле прикладывается к системе, когда в ней имеется сформировавшаяся отчетливая граница между раствором заряженных частиц и средой (растворитель, буферная смесь). В процессе ЭФ граница перемещается.

Зональный ЭФ основан на применении пористой стабилизированной среды (бумага, гель, блоки гранулированного материала). При электрофорезе молекулы одного типа группируются по зонам.

Стационарный (или вытесняющий) ЭФ характеризуется тем, что через некоторое время после начала разделения устанавливается состояние равновесия.

Рассмотрим детальнее перечисленные выше типы электрофоретического разделения на примерах белковых смесей.

В 20-30 годах прошлого столетия были выполнены интенсивные исследования электрохимических свойств белков. Они позволили установить, что молекулы белка представляют собой амфотерные полиэлектролиты, т.е. они несут на себе одновременно положительный и отрицательный заряд. В приложении к белкам термин “амфотерный” означает, что они титруются как кислотами, так и щелочами. Иными словами, молекула белка в довольно больших интервалах рН несет на себе одновременно положительные и отрицательные заряды. А в очень кислых средах (рН = 1) практически все белки имеют максимальный положительный заряд. В сильно щелочных (рН = 13) - максимальный отрицательный. Есть, правда, исключения. Гистоны, например, имеют положительный заряд даже при рН = 11.

Различие в зарядах белковых молекул впервые было использовано для разделения их смесей шведским исследователем Арне Тизелиусом в 1937г. Он сконструировал первый прибор для проведения электрофореза. За достижения в области электрофореза Тизелиус в 1948г был награжден Нобелевской премией.

Долгое время электрофорез оставался практически единственным количественным методом анализа белков. Он и сейчас весьма широко используется, хотя и уступает современным физико-химическим методам. В частности, хроматографии, гель-фильтрации, ультрацентрифугированию, центрифугированию в градиенте плотности.

В молекулах белков содержатся как основные, так и кислотные ионизирующиеся группы: карбоксильные, спиртовые, аминогруппы, гуанидиновые, фенольные, имидазольные, тиольные. Это ионогенные группы. Для каждого белка существует совершенно определенное значение рН среды, при котором суммарный заряд белковой молекулы равен нулю. Это изоэлектрическая точка (ИЭТ). В этой точке в молекуле белка содержится равное количество положительных и отрицательных зарядов. Это важно четко понимать. Нулевой заряд означает в данном случае не отсутствие зарядов, а равенство положительно и отрицательно заряженных групп в одной и той же молекуле. При значениях рН выше ИЭТ белок несет суммарный отрицательный заряд, а ниже ИЭТ - суммарный положительный. Белки сыворотки крови, в большинстве своем, имеют ИЭТ в области рН = 4-6. В электрическом поле положительно заряженные частицы движутся к катоду, а отрицательные к аноду.