Химия белка. Структура, свойства, методы исследования - Шендрик А.Н. 2022

Методы экспериментального исследования структуры белков
Методы разделения белков
Экспериментальные методы электрофореза - Двухмерный электрофорез

Так же как для бумажной и тонкослойной хроматографий, для электрофореза в ПААГ применим подход двухмерного разделения смесей. Проводят эксперимент обычно так. Вначале проводят разделение смеси методом ИЭФ. Затем в перпендикулярном направлении проводят ДСН-электрофорез. Разрешающая способность этого комбинированного метода чрезвычайно высока. Удается разделять смеси, содержащие 1000 и более белков. О’Фаррелл, автор этого метода, считает, что таким образом можно разделить смесь, включающую до 5000 белков. Двухмерные электрофоретические пластины (карты) являются своего рода “отпечатками пальцев”, характерными для источника из которого взят образец для анализа. Это своего рода “анатомия” на молекулярном уровне. В настоящее время ведется каталогизация таких карт, полученных для различных тканей человеческого организма. Цель - использование этой информации в диагностике заболеваний или при изучении развития заболеваний.

В качестве примера рассмотрим результаты эксперимента выполненного Патриком О’Фарреллом по двухмерному разделению белков E. Coli (см рис. 4.11).

Рис. 4.11 Вид радиоавтограммы, полученной после разделения белков E. coli выращенных на среде с меченными изотопом 14С аминокислотах

Клетки E. Coli выращивали на среде, содержащей аминокислоты меченные радиоактивным изотоп ¹⁴С. Затем лизировали клетки ультразвуком. 25 мкл лизата (=10мкг белка) наносили на гель в трубочках для проведения ИЭФ. Полученные после ИЭФ цилиндрики с гелем без трубочек укладывали вдоль края размещенного между двумя пластинками геля и проводили электрофорез с предварительной обработкой ДСН. По завершению электрофореза пластинки помещались на рентгеновскую пленку для экспонирования радиоактивности, меченных изотопом ¹⁴С белков. После проявления пленки была получена соответствующая карта белковой смеси (всего 1100 разрешенных пятен) из клеток E.Coli.