Химия белка. Структура, свойства, методы исследования - Шендрик А.Н. 2022

Методы экспериментального исследования структуры белков
Методы разделения белков
Экспериментальные методы электрофореза - Иммуноэлектрофорез

Это двухстадийный вариант электрофореза, предложенный в 1953г Пьером Грабаром. Вначале смесь веществ разделяют методом гель-электрофореза, а затем выявляют компоненты смеси посредством иммунодиффузии. Методом иммуноэлектрофореза можно анализировать только те компоненты, которые дают реакцию преципитации с антителами, т.е. в основном белки.

Проводят иммуноэлектрофорез на горизонтальных пластинках с использованием агарового или агарозного гелей. Наносят однородный слой геля на пластинку и в этом слое делают два углубления: одно в форме ямки, второе - желобка (см.рис.). В ямку помещают смесь белков-антигенов и проводят обычный электрофорез. Белки смеси в ходе ЭФ движутся в соответствии с зарядами их молекул и распределяются по пластинке. По завершению электрофореза в желобок вносят антисыворотку с антителами. Антитела из сыворотки и распределившиеся по пластине антигены начинают диффундировать навстречу друг другу. При встрече антиген и антитело образуют нерастворимый комплекс антиген-антитело (преципитат), который выпадает в осадок. При этом образуются видимые искривленные преципитатные линии (дужки) элипсоидной формы. Положение этих дужек на пластине определяется коэффициентом диффузии антигена, т.к. антитела имеют очень близкие массу и форму, а следовательно и почти одинаковые коэффициенты диффузии. Количество образовавшихся дужек соответствует числу различных антигенов, находящихся в смеси. Этот метод позволяет выявлять и разделять белки смеси с одинаковой электрофоретической подвижностью, но различными коэффициентами диффузии.

Пример практического использования ЭФ для определение pI белков

Как известно, pI аминокислот можно рассчитать, зная рК_а их ионогенных групп. Определить рI полипептида так нельзя. Поэтому, для нахождения рI пептидов можно поступить следующим образом.

> Измерить подвижность пептида при нескольких различающихся величинах рН.

> Построить график зависимости подвижности от рН (см. рис.).

> Определить из графика значение рН, при котором электрофоретическая подвижность равна нулю.

Знание положения изоэлектрической точки для белка имеет важное значение при его выделении из смеси, поскольку при рН = рI растворимость белка минимальна.