БИОХИМИЯ - Л. Страйер - 1984

ТОМ 3

Часть IV ИНФОРМАЦИЯ

ГЛАВА 24 ДНК: ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РОЛЬ, СТРУКТУРА И РЕПЛИКАЦИЯ

24.5. Комплементарные цепи служат матрицами друг для друга при репликации ДНК

Модель двухспиральной молекулы ДНК позволила сразу же предложить механизм репликации ДНК. Уотсон и Крик опубликовали свою гипотезу через месяц после того, как представили модель структуры ДНК в виде прекрасной статьи, отличавшейся простотой и ясностью.

«Если задан определенный порядок оснований в одной из цепей, можно написать точную последовательность оснований в другой цепи, поскольку спаривание специфично. Таким образом, каждая из цепей комплементарна другой цепи, и именно это свойство подсказывает, каким образом может удваиваться молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты.

Прежние дискуссии о самоудвоении всегда опирались на представление о некой матрице или каком-то шаблоне. Предполагалось, что матрица копирует непосредственно самое себя, или должна образовывать «негатив», который в свою очередь действует в качестве матрицы и образует исходный «позитив». Ни в одном случае не было предложено детального объяснения, как это могло бы происходить на уровне атомов и молекул.

В нашей модели дезоксирибонуклеиновой кислоты имеется, по существу, пара матриц, причем каждая из них комплементарна другой. Мы полагаем, что перед удвоением водородные связи разрываются и две цепи раскручиваются и расходятся. Затем каждая цепь используется в качестве матрицы для образования на ней новой комплементарной цепи, так что в конце концов у нас будет две пары цепей, тогда как раньше была только одна. Более того, при таком способе репликация последовательность пар оснований будет в точности удвоена».

24.6. Репликация ДНК полуконсервативна

Уотсон и Крик предположили, что одна из цепей каждой дочерней молекулы ДНК синтезируется заново, а другая происходит от родительской молекулы ДНК. Такое распределение атомов родительской молекулы называют полуконсервативным. Метью Меселсон и Франклин Сталь (Matthew Meselson, Franklin Stahl) поставили принципиально важный эксперимент для проверки этой гипотезы. Родительскую ДНК пометили тяжелым изотопом азота ¹⁵N, чтобы сделать ее более тяжелой, чем обычная ДНК. Для этого выращивали Е. coli в течение многих поколений в среде, содержавшей в качестве единственного источника азота ¹⁵NH₄Cl. Затем бактерии быстро переносили в среду, содержавшую 14N-стабильный изотоп азота. Этот эксперимент должен был показать, как распределяются изотопы ¹⁴N и ¹⁵N в молекулах ДНК в ходе последующих циклов репликации.

Распределение ¹⁴N и ¹⁵N в потомстве изучали с помощью только что разработанного метода равновесной седиментации в градиенте плотности. Небольшое количество ДНК растворяют в концентрированном растворе хлористого цезия с плотностью, близкой к плотности ДНК (~1,7 г/см³). Этот раствор центрифугируют почти до равновесного состояния. Под действием противодействующих процессов седиментации и диффузии в центрифужной ячейке возникает градиент концентрации хлористого цезия. В результате создается устойчивый градиент плотности от 1,66 до 1,76 г/см³. Под действием центробежной силы молекулы ДНК переходят в ту область градиента, в которой плотность раствора равна их собственной плавучей плотности. Высокомолекулярная ДНК образует четко выраженную полосу, обнаруживаемую по поглощению ультрафиолетового света. Молекулы ¹⁴N-ДНК и ¹⁵N-ДНК хорошо разделяются в таком градиенте, поскольку их плотность различается примерно на 1% (рис. 24.14).

Рис. 24.14. Разделение ¹⁴N- и 15N-ДНК при центрифугировании в градиенте плотности. А - фотография центрифужной ячейки в ультрафиолетовом свете; Б - денситометрическая кривая поглощения, полученная при сканировании фотографии, приведенной на рис. А

ДНК выделяли из бактерий через различные промежутки времени после переноса со среды, содержащей ¹⁵N, на ¹⁴N. Анализ этих образцов центрифугированием в градиенте плотности показал, что после одного цикла репликации ДНК дает одну полосу (рис. 24.15). Плотность этой полосы была равна в точности среднеарифметическому значению между плотностью ¹⁵N и ¹⁵N-ДНК. Отсутствие ¹⁵N-ДНК свидетельствовало о том, что целостность родительской ДНК в ходе репликации нарушается. Отсутствие ¹⁴N-ДНК показывало, что часть атомов всех дочерних молекул ДНК происходила от родительской ДНК. Соотношение ¹⁴N и ¹⁵N в дочерних молекулах должно составлять 1:1, так как плотность гибридных молекул ДНК была средней между ¹⁴N- и ¹⁵N-ДНК.

Рис. 24.15. Доказательство полуконсервативной репликации в клетках Е. coli с помощью центрифугирования в градиенте плотности. Положение полосы ДНК зависит от содержания ¹⁴N и ¹⁵N. После 1,0 генерации все молекулы ДНК представляют собой гибриды, содержащие равное количество ¹⁴N и ¹⁵N. Родительская ДНК (¹⁵N) после 1,0 генерации не обнаруживается

После двух циклов репликации ДНК распределялась поровну в двух полосах. Одна из них - гибридная ДНК, другая - ¹⁴N-ДНК. Меселсон и Сталь сделали из этих убедительных экспериментов вывод, «что азот молекул ДНК распределяется поровну между двумя физически раздельными структурами, что после удвоения каждая дочерняя молекула получает одну из этих структур и что эти структуры сохраняются интактными в течение многих удвоений». Полученные результаты прекрасно согласовывались с моделью репликации ДНК Уотсона- Крика (рис. 24.16).

Рис. 24.16. Схема полуконсервативной репликации. Родительская ДНК изображена зеленым, а новосинтезированная - красным