БИОХИМИЯ - Л. Страйер - 1984

ТОМ 3

Часть IV ИНФОРМАЦИЯ

ГЛАВА 31. ПЕРЕСТРОЙКИ ГЕНОВ: РЕКОМБИНАЦИЯ, ТРАНСПОЗИЦИЯ И КЛОНИРОВАНИЕ

Заключение

При генетической рекомбинации новая молекула ДНК образуется путем разрыва и воссоединения цепей ДНК. Взаимообмен может произойти между любой парой гомологичных последовательностей родительских молекул ДНК, и потому этот процес называется общей генетической рекомбинацией. У Е. coli общая рекомбинация осуществляется под действием генов гес. Белок recВС - нуклеаза; она образует одноцепочечную ДНК, которая может внедряться в двухцепочечную молекулу ДНК. Эта реакция связывания одноцепочечной молекулы катализируется белком recА, который одновременно гидролизует АТР.

В генетических перестройках негомологичных локусов участвуют подвижные генетические элементы, называемые транспозонами (элементы, способные к переносу - транспозиции). Плазмиды (небольшие кольцевые двухцепочечные ДНК) - важный класс подвижных генетических элементов. Эти дополнительные хромосомы несут гены, отвечающие за инактивацию антибиотиков, метаболизм природных соединений и образование токсинов. Плазмиды могут реплицироваться автономно или интегрировать с хромосомой клетки-хозяина. Фактор F (фактор плодовитости) - плазмида, сообщающая бактериям способность передавать гены другим бактериям путем конъюгации. Для коньюгации необходим непосредственный физический контакт между донорной (F+) и реципиентной (F-) клетками. Плазмиды факторы R обеспечивают устой-

чивость к антибиотикам. Более крупные из этих плазмид содержат фактор переноса устойчивости (RTF), обусловливающий переход плазмиды в другую бактерию при коньюгации. Некоторые гены, обеспечивающие устойчивость к антибиотикам, могут быть сцеплены с областью RTF. Поэтому множественная устойчивость к лекарственным средствам может быть трансмиссивной. Транспозоны обладают высокой подвижностью, так как они обрамлены IS- элементами. Эти концевые последовательности направляют действие белков, участвующих в их интеграции с ДНК. Транспозон не обязательно гомологичен реципиент- ной ДНК.

В лаборатории можно создать новые сочетания неродственных генов и клонировать их в клетках-хозяевах. Прежде всего синтезируется рекомбинантная молекула ДНК путем соединения какого-либо фрагмента ДНК с ДНК вектора, который может автономно реплицироваться в подходящем хозяине. Наиболее подходящие векторы - фаг лямбда, вирус SV-40 и плазмиды. Ферменты рестрикции и ДНК-лигаза - основные инструменты для получения новых молекул ДНК. Липкие концы, гомополимерные концевые фрагменты и химически синтезированные линкеры - три способа соединения молекул ДНК. Рекомбинантные молекулы ДНК можно ввести в клетки-хозяева, заражая их реконструированным вирусом или инкубируя их в присутствии голых молекул ДНК. Последний этап заключается в отборе клеток, несущих нужную молекулу рекомбинантной ДНК, с использованием какого- либо отличительного свойства введенного гена (например, устойчивости к антибиотику). Имея рестриктазный гидролизат геномной ДНК, можно клонировать в клетках Е. coli определенные эукариотические гены. Многие эукариотические гены могут транскрибироваться и транслироваться в бактериальных клетках. Клонирование генов — мощный метод исследования организации и выражения сложных генов. Кроме того, технология рекомбинантных ДНК - весьма многообещающий метод для синтеза больших количеств генов и белков, имеющихся в обычных клетках в ничтожных количествах.