БІОХІМІЯ - Підручник - Остапченко Л. І. - 2012

Розділ 9.НУКЛЕЇНОВІ КИСЛОТИ

9.4.Структура нуклеїнових кислот

9.4.4.Денатурація і ренатурація ДНК

У з'ясуванні будови й біологічної ролі ДНК мають важливе значення дослідження механізмів її денатураційних і ренатураційних перетворень. Оскільки два ланцюги ДНК зв'язані між собою тільки нековалентними зв'язками (водневими) і міжплощинною взаємодією між сусідніми основами, молекула ДНК за дії фізичних або хімічних факторів здатна розчленовуватися на окремі ланцюги і приймати конформацію неупорядкованого клубка. Процес розділення ланцюгів ДНК називають денатурацією, або плавленням, подвійної спіралі.

Дволанцюгова спіральна ДНК у розчині легко руйнується при нагріванні до температур, близьких до 100 °С, а також при збільшенні рН розчину до рівня, за якого руйнуються водневі зв'язки між основами. Інші фактори (наприклад, одно- та двовалентні катіони, поліаміни й білки) впливають на денатурацію шляхом часткової або повної нейтралізації від'ємно заряджених фосфатних груп у молекулі нуклеїнової кислоти.

Дія перерахованих факторів приводить до порушення нативної двоспіральної конформації молекули ДНК - розташування пуринових і піримідинових нуклеотидів стає менш упорядкованим і супроводжується кардинальними змінами багатьох фізичних властивостей ДНК. Особливо суттєвими є підвищення поглинання в ультрафіолетовій області (з максимумом, близьким до 260 нм, що є характерним для кожної основи). Зростання оптичної густини при денатурації ДНК відоме як гіперхромний ефект.

Інтервал значень температури або рН, за яких відбувається денатурація ДНК дуже незначний; характерними параметрами процесу є температура плавлення (Тпл) або рН плавлення (рНпл), які означають середню точку температурного або рН-діапазону, за якого відбувається розділення ланцюгів ДНК (рис. 9.14). Висхідна ділянка кривої відповідає певному інтервалу температур (рис. 9.14, А) або рН (рис. 9.14, Б), за якого відбувається повне роз'єднання двоспіральної ДНК. Температура або рН належать до відтворювальних фізичних властивостей молекули ДНК в певних умовах.

Рис. 9.14. Криві денатурації типової дволанцюгової ДНК при підвищенні температури (А) і рН середовища (Б)

Оскільки для руйнування двох водневих зв'язків АТ-пар необхідно менше енергії, ніж для розриву трьох водневих зв'язків ГЦ-пар, значення температури або рН, за яких відбувається денатурація, залежить від нуклеотидного складу ДНК. Чим вищий вміст ГЦ-пар, тим вища Тпл або рНпл (рис. 9.15). При денатурації в першу чергу плавляться АТ-збагачені ділянки ДНК.

Рис. 9.15. Криві плавлення ДНК залежно від нуклеотидного складу молекул

Денатурація - процес оборотний. За певних умов два розділені комплементарні ланцюги ДНК можуть відновити подвійну спіраль.

Це явище називається ренатурацією, реасоціацією, або відпалом, і відбувається при зменшенні температури або рН. При повільному охолодженні або зменшенні рН раніше неупорядковані окремі ланцюги ДНК завдяки спарюванню основ знову утворюють подвійну спіраль - молекула ренатурує. Молекули ДНК, однорідні за нуклеотидним складом, ренатурують із більшою швидкістю.

Здатність до ренатурації ДНК використовується для одержання даних щодо кількості гомологічних послідовностей у дослідних зразках нуклеїнових кислот. Для цього користуються методом, який ґрунтується на утворенні гібридних дуплексів (гетеродуплексів) між ДНК і РНК або між двома ланцюгами ДНК, які виділено з різних організмів. У результаті дослідження гібридизації виявлено таку закономірність: чим більша спорідненість двох видів, тим більшою є здатність їх ДНК до утворення гібридів. Метод молекулярної гібридизації дозволяє вивчати спорідненість ДНК різних видів і робити висновки про їхню генетичну подібність.