ФІЗІОЛОГІЯ ТА БІОХІМІЯ РОСЛИН

Опорний конспект лекцій

6. ДИХАННЯ РОСЛИН

Утворені в результаті фотосинтезу цукри та інші органічні сполуки використовуються клітинами рослинного організму як поживні речовини. Найважливішим етапом живлення органічними речовинами на клітинному рівні виступає процес дихання.

Клітинне дихання - це окиснюючий (з участю кисню) розпад органічних поживних речовин, що супроводжується утворенням хімічно активних метаболітів і звільненням енергії, які використовуються клітиною для процесів життєдіяльності.

Загальні положення та рівняння дихання

У природі існують два основні процеси, у ході яких енергія сонячного світла, що була акумульована рослиною в органічній речовині, звільняється, це - дихання та бродіння.

Дихання - це аеробний окиснювальний розпад органічних сполук на прості, неорганічні, що супроводжується виділенням енергії.

Бродіння - анаеробний процес розпаду органічних речовин на простіші (органічні), що також супроводжується виділенням енергії.

У разі дихання акцептором електронів в окисно-відновних реакціях є кисень, тоді як під час бродіння - органічні сполуки.

Наукові основи про роль О₂ в диханні були закладені працями А. Лавуазьє, Я. Інгенхауза, І. Бородіна, О. Баха, К. Енглера. У другій половині 19 ст. спільними зусиллями вчених запропоновано загальне рівняння цього процесу:

С₆Н₁₂О₆ + 6О₂ = 6СО₂ + 6Н₂О + Е (2875 кДж/моль).

Одночасно О.М. Бах наголошував на тому, що біологічне окиснення пов'язане з відніманням від субстрату електронів чи протонів.

Ця гіпотеза О.М. Баха надалі була розвинена В.І. Палладіним у струнку теорію хімізму дихання. Положення його теорії про анаеробну й аеробну фази дихання та про роль води у цих процесах повністю підтвердилися.

Основні положення теорії біологічного окиснення (теорії Баха-Палладіна):

✵ обов’язковим учасником дихання є вода;

✵ вода разом із субстратом окиснення виконує функцію донора водню;

✵ у процесі дихання беруть участь специфічні активатори водню, які вилучають водень із субстрату;

✵ перші етапи дихання є анаеробними і не вимагають наявності молекулярного кисню;

✵ молекулярний кисень необхідний на завершальному етапі дихання для регенерації акцепторів водню з утворенням води.

Експериментальні дані про участь води в окисненні субстрату дихання й роль О₂ як кінцевого акцептора водню були отримані у 50-х рр. минулого століття і висвітлені в працях Б. Вартапетяна й А. Курсанова.

Завдяки дослідженням Костичева, Нейберга стало очевидно, що дихання та всі види бродіння пов'язані між собою через піровиноградну кислоту і що існує генетичний зв'язок між диханням та бродінням.

Дихання є одним із проявів обміну речовин між організмом і навколишнім середовищем, у результаті чого відбувається генерування енергії у вигляді АТФ, відновлювальних еквівалентів (НАД-Н₂, НАДФ-Н₂) та формування проміжних продуктів для різноманітних біосинтетичних реакцій рослинного організму. Процес дихання складається з трьох етапів:

✵ гліколізу,

✵ циклу трикарбонових кислот (цикл Кребса),

✵ дихального ланцюга.

На перших двох етапах (гліколіз, цикл трикарбонових кислот) відбувається відновлення коферментів (НАД·Н₂, НАДФ·Н₂), які на третьому етапі окиснюються киснем повітря в дихальному ланцюзі мітохондрій.

Внаслідок дихання в організмі виникає взаємозв’язок між розкладом і синтезом основних хімічних сполук, які беруть участь у процесах обміну. Також відбувається газообмін із навколишнім середовищем: кисень поглинається, а виділяється вуглекислий газ.

Основні шляхи окиснення дихальних субстратів

Окиснення субстратів (S) у ході дихання здійснюється ферментами (ф). Ферменти, як біокаталізатори, мають декілька особливостей: високу активність, специфічність та лабільність. Ці властивості забезпечують можливість тонкої регуляції обміну речовин на рівні ферментів.

Існує 4 способи окиснення:

1. віднімання е^- (Fe²⁺ → Fe³⁺);

2. віднімання водню (гідрохінон → хінон + 2е^- + 2Н⁺);

3. приєднання О₂ (2Н₂ + О₂→ 2Н₂О);

4. утворення проміжної гідратованої сполуки з подальшим відніманням двох електронів і протонів:

СН₃ — СОН + Н₂О → СН₃ - СН(ОН)₂→ (-2е^-, -2Н⁺) СН₃СООН

Оксидоредуктази

Оскільки окиснення однієї речовини - Д (донора е^- чи Н⁺) пов'язане з відновленням іншої сполуки - А (їх акцептора), то ферменти, які каталізують ці реакції, називають окисно-відновними ферментами, або оксидоредуктазами. Усі вони належать до першого класу ферментів і поділяються на 17 підкласів:

Існує декілька груп оксидоредуктаз: анаеробні дегідрогенази, аеробні дегідрогенази, оксидази та оксигенази.

Анаеробні дегідрогенази - передають електрони різним проміжним акцепторам, але не О₂. Це двокомпонентні ферменти, коферментом яких може бути НАД⁺ (алкоголь-, лактат-, малатдегідрогенази) або НАДФ⁺ (ізоцитрат-, глюкозофосфатдегідрогенази). При окисненні субстрату НАД⁺ (НАДФ⁺) перетворюється у відновлену форму НАДН (НАДФН), а другий протон субстрату дисоціює у середовище. Окислені й відновлені форми коферментів анаеробних дегідрогеназ можуть взаємоперетворюватися:

НАД₁Н + НАД₂⁺⇔ НАД₁⁺ + НАД₂Н.

Анаеробні дегідрогенази передають водень, тобто е^- і Н⁺, різним проміжним переносникам і аеробним дегідрогеназам.

Аеробні дегідрогенази - транспортуванняють е^- до різних акцепторів, в тому числі й до О₂. Це також двокомпонентні ферменти - флавопротеїни. Крім білка, до їхнього складу входить міцно зв'язана простетична група - похідне рибофлавіну (вітамін В₂).

Розрізняють два коферменти цієї групи: флавінмононуклеотид (ФМН), або жовтий дихальний фермент Варбурга, і флавінаденіндинуклеотид (ФАД) (сукцинатдегідрогеназа). Активною групою цих ферментів є ізоаллоксазин. Акцептори електронів для аеробних дегідрогеназ - це хінони, цитохроми, О₂.

Оксидази - здатні передавати е^- лише кисню. При цьому утворюється:

вода - на О₂ переноситься 4е^- (цитохромоксидаза, поліфенолоксидаза);

пероксид водню - на О₂ переноситься 2е^- (флавопротеїнові оксидази);

супероксидний аніон кисню (О^-₂) - на О₂ переноситься 1е^- (ксантиноксидаза).

Н₂О₂ і О^-₂ - токсичні і в клітинах швидко трансформуються на воду й кисень. Серед оксидаз важливу роль відіграють залізовмісні ферменти й переносники, які належать до цитохромної системи. До неї входять цитохроми (в, с₁, с) і цитохромоксидаза (цит. а+а₃). Уся система передає е^- від флавопротеїнів на молекулу кисню. В ланцюгу дихання напрям передачі е^- визначається величиною окисно-відновного потенціалу цитохромів:

цит. в → цит. с₁ → цит. с → цит. а+а₃→ О₂.

Усі компоненти цитохромної системи містять залізопорфіринову простетичну групу. Інгібіторами цитохромоксидази є СО, ціанід, азид. У рослинних мітохондріях існує оксидаза, яка не пригнічується цими речовинами і називається альтернативною оксидазою.

Рослинні тканини містять також немітохондріальні оксидази:

- поліфенолоксидаза (перенос електронів і протонів від фенолів на кисень);

- аскорбатоксидаза (окиснює аскорбінову кислоту до дегідроаскорбінової кислоти);

- група пероксидаз (використовують як окиснювач пероксид водню: АН₂ + Н₂О₂→ А + 2Н₂О; можуть функціонувати як оксидази, або анаеробні дегідрогенази);

- каталаза (розкладає пероксид з утворенням молекулярного кисню: 2Н₂О₂ → 2Н₂О + О₂ ↑).

Оксигенази - активують кисень, у результаті чого він сполучається з органічними речовинами:

- диоксигенази приєднують два атоми кисню;

- гідроксилази приєднують один атом кисню (монооксигенази).

Донором е^- для оксигеназ слугують НАД(Ф)Н, ФАДН₂ та ін. сполуки. Ці ферменти беруть участь у гідроксилюванні багатьох ендогенних сполук (амінокислот, фенолів, стеринів), а також у детоксикації чужорідних токсичних речовин.

Гідроксилази здійснюють реакцію гідроксилювання за схемою:

АН + О₂ + ДН₂→ АОН + Д + Н₂О.

Диоксигенази приєднують два атоми кисню в найрізноманітніші групи:

НАН + О₂→ НО-А-ОН

НО-А-ОН + О₂→ НОО-А-ООН

А + О₂ +ДН₂→ НО-А-ОН + Д та ін.

Гліколіз

Гліколіз - процес анаеробного розпаду глюкози, що проходить із вивільненням Е, кінцевим продуктом якого є піровиноградна кислота (ПВК). Гліколіз - загальний спільний етап аеробного дихання і всіх видів бродіння.

Реакції гліколізу протікають у розчинній частині цитоплазми і в хлоропластах. У цитозолі гліколітичні ферменти організовані в мультиензимні комплекси на активних філаментах цитоскелету, що забезпечує векторність процесу. Англійський біохімік А. Гарден і російський фізіолог Л. Іванов установили, що глюкоза піддається анаеробному розпаду лише після фосфорилювання. Повністю весь процес гліколізу розшифрували німецькі біохіміки Г. Ембден і О. Меєргоф та радянський біохімік Я. Парнас.

Етапи гліколізу (біохімія процесу)

Ланцюг реакцій гліколізу можна розподілити на три етапи.

1. Підготовчий етап - фосфорилювання гексози та її розщеплення на дві фосфотріози. Глюкоза (піранозна форма молекули) фосфорилюється АТФ з участю гексокінази, перетворюючись у глюкозо-6-фосфат, який ізомеризується глюкозофосфатізомеразою у фруктозо-6-фосфат. Цей перехід необхідний для утворення більш лабільної фуранозної форми молекули гексози. Фруктозо-6- фосфат фосфорилюється за участю АТФ фосфофруктокіназою. В результаті утворюється фруктозо-1,6-дифосфат.

Фруктозо-1,6-дифосфат - лабільна форма із симетрично розміщеними фосфатними групами, що несуть від'ємний заряд і відштовхуються один від одного електростатично. Така структура легко розщеплюється альдолазою. Таким чином, суть підготовчого етапу полягає в активації стабільної глюкози за рахунок подвійного фосфорилювання і переходу у фуранозну форму з подальшим розпадом на 3-фосфогліцериновий альдегід (3ФГА) і фосфодіоксіацетон (ФДА), які легко перетворюються один в одного (тріозофосфатізомераза).

2. Перше субстратне фосфорилювання, яке починається з 3ФГА і завершується утворенням 3-фосфогліцеринової кислоти (3ФГК).

Фермент дегідрогеназа фосфогліцеринового альдегіду (НАД-залежний БН- фермент) утворює з 3ФГА фермент-субстратний комплекс, в якому відбувається окиснення субстрату та передача е^- і Н⁺ на НАД⁺. У ході окиснення ФГА у фермент-субстратному комплексі виникає меркаптанний високоенергетичний зв’язок (зв’язок із високою вільною енергією гідролізу).

Фосфороліз цього зв'язку звільняє SH-фермент, а до залишку карбоксильної групи субстрату приєднується неорганічний фосфат (зберігаючи Е окиснення 3ФГА). В результаті утворюється 1,3-диФГК.

Високоенергетична фосфатна група з допомогою фосфогліцераткінази передається на АДФ і утворюються АТФ і 3ФГК.

Таким чином, на другому етапі гліколізу на кожну окиснену тріозу синтезуються 1 молекула АТФ і 1 молекула відновленого НАДН.

3. Друге субстратне фосфорилювання, при якому 3ФГК за рахунок внутрішньомолекулярного окиснення віддає фосфат з утворенням АТФ.

3ФГК за допомогою фосфогліцератмутази перетворюється в 2ФГК. Дальше енолаза каталізує відщеплення молекули води від 2ФГК, що супроводжується перерозподілом Е в молекулі. В результаті цього утворюється фосфоенолпіруват - сполука, яка містить високоенергетичний фосфатний зв'язок. Цей фосфат з участю піруваткінази передається на АДФ, а енолпіруват переходить до більш стабільної форми - піруват.

Енергетичний вихід гліколізу

На 2 і 3-му етапах утворюється 4 мол. АТФ і 2 мол. НАДН, на першому етапі витрачається 2 мол. АТФ. Окиснення 1 мол. НАДН = синтезу 3-х мол. АТФ. Таким чином, у процесі гліколізу утворюється 8 молекул АТФ.

Вільна енергія гідролізу 1 молекули АТФ = 41, 87 кДж/моль (10 ккал), а 8 молекул АТФ дають 335 кДж/моль (80 ккал).

Зворотність гліколізу визначається зворотністю дії більшості ферментів. Однак реакції фосфорилювання глюкози й фруктози, а також реакція утворення піровиноградної кислоти, які здійснюються за допомогою кіназ, вимагають затрати енергії макроергічних зв’язків. На цих ділянках зворотний процес може відбуватися завдяки використання обхідних шляхів.

Функції гліколізу в клітині:

- здійснює зв'язок між субстратами дихання й циклом Кребса;

- постачає на потреби клітини АТФ і НАДН (в умовах аноксії - основне джерело АТФ);

- продукує інтермедіати, необхідні для синтетичних процесів у клітині;

- у хлоропластах - дає АТФ; метаболізує крохмаль у тріози, які експортуються до цитозолю.

Цикл Кребса

Враховуючи результати своїх попередників (Т. Тунберга, А. Сент-Дьєрди) та власні дослідження, англійський біохімік Г.А. Кребс запропонував схему окиснення ди- і трикарбонових кислот до СО₂ через »цикл лимонної кислоти» за рахунок віднімання водню. Таким чином у 1937 р. на тваринних об'єктах був відкритий цикл Кребса, а в 1939 р. англійським дослідником А. Чібнелом була доведена його наявність у рослин.

У циклі Кребса при наявності кисню піруват повністю окиснюється до СО₂ і Н₂О. Усі ділянки цього процесу локалізовані в матриксі або на внутрішній поверхні мітохондрій. Виділяють 8 етапів.

1) Безпосередньо в циклі окиснюється не сам піруват, а його похідне - ацетил-КоА. Тому перший етап - це утворення активного ацетилу в ході окисного декарбоксилювання. Цей процес здійснюється з участю піруватдегідрогеназного мультиферментного комплексу (входять 3 ферменти і 5 коферментів: тіамінпірофосфат, ліпоєва кислота, коензими А, ФАД і НАД⁺). У ході складних перетворень через проміжні сполуки з коферментами із ПВК утворюються ацетил-КоА (що містить високоенергетичний тіоефірний зв'язок), СО₂ і НАДН.

2) Цикл Кребса починається із взаємодії ацетил-КоА з енольною формою щавлево-оцтової кислоти (оксалоацетату), які при дії цитратсинтази перетворюються в лимонну кислоту. При цьому витрачається Е тіоефірного зв'язку.

3) Наступний етап циклу містить дві реакції і каталізується ферментом аконітатгідратазою:

- перша - в результаті дегідратації лимонної кислоти (цитрату) утворюється цис-аконітова;

- друга - аконітат гідратується і синтезується ізолимонна кислота.

4) Ізолимонна кислота під дією НАД-залежної ізоцитратдегідрогенази окиснюється в нестійку сполуку - щавлевобурштинову кислоту (оксалосукцинат), яка декарбоксилюється з утворенням α-кетоглутарової кислоти.

5) α-кетоглутарат піддається реакції окиснювального декарбоксилювання → α-кетоглутарат-дегідрогеназний мультиферментний комплекс — у результаті чого виділяється СО₂, утворюється НАДН і сукциніл-КоА - високоенергетичний тіоефір.

5’) За участю сукциніл-КоА-синтетази із сукцинілу-КоА, АДФ і Н₃РО₄ утворюється бурштинова кислота, АТФ (субстратне фосфорилювання), регенерує молекула КоА.

6) Бурштинова кислота (сукцинат) окиснюється до фумарової - ФАД- залежна сукцинатдегідрогеназа.

7) Фумарова кислота при дії фумаратгідратази, приєднуючи Н₂О, перетворюється в яблучну (малат).

8) Яблучна кислота з допомогою НАД-залежної малатдегідрогенази окиснюється в щавлевооцтову, яка самочинно переходить в енольну форму, реагуючи з черговою молекулою ацетил-КоА, і цикл повторюється.

Цикл Кребса практично незворотний, оскільки в ньому є дві сильно екзергонічні реакції - цитрат-синтетазна [2-га реакція] і сукциніл-КоА-синтетазна [5-та реакція]. Протягом одного обороту циклу при окисненні пірувату виділяється 3 молекули СО₂ [1, 4, 5 реакції], відбувається залучення 3-х молекул Н₂О [2, 5', 7 реакції] і видалення 5-ти пар атомів водню [1, 4, 5, 6, 8 реакції].

Значення та енергетичний вихід

Цикл Кребса відіграє дуже важливу роль в обміні речовин рослинного організму. Він служить кінцевим етапом окиснення не лише вуглеводів, але й білків, жирів та інших сполук. У ході реакцій циклу звільняється основна кількість енергії, яка міститься в субстраті, і більша її частина утилізується у високоенергетичних фосфатних зв’язках.

У ході окиснення пірувату мають місце 5 дегідрувань, при цьому утворюються 3НАДН [1, 5, 8 реакції], НАДФН [4 реакція] і ФАДН₂ [6 реакція] (1ФАДН₂ = 2АТФ), + 1 мол. АТФ при субстратному фосфорилюванні (5’ реакція) → всього 15 молекул АТФ, а для 2-х молекул ПВК = 30 молекул АТФ.

Отже, при окисненні глюкози в процесі дихання за функціонування гліколізу й циклу Кребса утворюється 38 молекул АТФ, що дорівнює 1591 кДж/моль (380 ккал/моль). Це становить 55% усієї енергії глюкози.

Значення циклу Кребса цим не вичерпується. Багато проміжних продуктів циклу використовується для синтезу різноманітних сполук (амінокислот, жирів, вуглеводів, поліізопренів і т. д.)

Цикл Кребса займає центральне місце в метаболізмі клітини. Через нього встановлюється зв'язок між обміном трьох найважливіших груп сполук - білків, жирів і вуглеводів.

Гліоксилатний цикл

Вперше описаний у 1957 р. Г. Корнбергом, Г. Кребсом. Відсутній у тварин. Гліоксилатний цикл можна розглядати як модифікацію циклу Кребса. Функціонує в проростаючому насінні олійних культур і в тих об'єктах, де запасні жири перетворюються в цукри (глюконеогенез).

Схема циклу:

Гліоксилатний цикл (цикл гліоксилової кислоти) локалізований у спеціальних мікротілах — гліоксисомах. У циклі беруть участь дві молекули ацетил-КоА і перша використовується для синтезу бурштиновоної кислоти. Бурштинова кислота виходить з гліоксисом, перетворюється на ЩОК і бере участь у глюконеогенезі (зворотній гліколіз) та інших біохімічних процесах. Цикл містить, як мінімум, 6 реакцій.

Гліоксилатний цикл дозволяє утилізувати запасні жири, при розпаді яких утворюється велика кількість молекул ацетил-КоА. Крім цього, на кожні 2 молекули ацетил-КоА в гліоксилатному циклі відновлюється 1 молекула НАДН.

Пентозофосфатний шлях окиснення глюкози (ПФШ)

У рослинних клітинах існує ще один спосіб метаболізму гексоз - пентозофосфатний шлях (ПФШ), або апотомічне окиснення.

Усі реакції протікають у розчинній частині цитоплазми клітини, у пропластидах і хлоропластах. Цей шлях особливо активний у тих клітинах, де інтенсивно проходять синтетичні процеси. При ПФШ АТФ не утворюється.

Етапи ПФШ

І. Окиснення глюкози - каталізується дегідрогеназнодекарбоксилюючою системою, яка складається з трьох ферментів:

Таким чином, при окисненні кожного атома вуглецю (дегідрування) утворюється два НАДФН.

ІІ. Рекомбінація сахарів для регенерації вихідного субстрату.

З рибульозо-5-фосфату під дією епімерази утворюється ксилульозо-5-фосфат, а під дією ізомерази - рибозо-5-фосфат.

Рекомбінація цукрів з участю транскетолази і трансальдолази призводить до появи 3-ФГА і седогептульозо-7-фосфату, потім еритрозо-4-фосфату й фруктозо-6-фосфату.

Нарешті утворюються фруктозо-6-фосфати, які ізомеризуються (гексозофосфатізомераза) у глюкозо-6-фосфат.

Вкінці з шести молекул глюкозо-6-фосфату регенерує п’ять молекул глюкозо-6- фосфату. Сумарне рівняння ПФШ має такий вигляд:

6Глюкозо6Ф +12 НАДФ⁺ + 7Н₂О → 5Глюкозо6Ф + 6СО₂ + 12НАДФН + 12Н⁺ + Н₃РО₄

Енергетичний вихід ПФШ і його значення

При апотомічному окисненні глюкозо-6-Ф утворюється НАДФН, який окиснюється повільніше, ніж НАДН. Зазвичай атоми водню передаються з НАДФН на НАД⁺, а лише потім - до електронно-транспортного ланцюга.

Енергетичний вихід ПФШ = 12НАДФН = 12 · 3 АТФ = 36 АТФ. Однак головне значення ПФШ не в енергетичному, а в пластичному обміні. Тут можна виділити декілька аспектів:

1) ПФШ служить головним немітохондріальним джерелом НАДФН, який використовується переважно в синтетичних реакціях (синтез жирів, ізопреноїдів, відновлення SН-сполук).

2) У ході ПФ циклу синтезуються пентози, які входять до складу нуклеотидів, АТФ, коферментів НАД⁺, ФАД, коферменту А та ін. сполук.

3) ПФШ є джерелом вуглеводів із різною кількістю вуглецевих атомів - від С₃ до С₇, які є попередниками ароматичних амінокислот, вітамінів, дубильних, ростових та ін. речовин.

4) Компоненти ПФШ беруть участь у темновій фіксації СО₂. ПФШ є, по суті, зворотним циклом Кальвіна.

5) У хлоропластах ПФШ у темноті постачає НАДФН, а також 3ФГК і, т.ч., АТФ, підтримуючи їх кількість на певному рівні.

Окиснення глюкози по ПФШ йде 12-ма реакціями, а дихотомічний (гліколітичний) шлях через ПВК охоплює більше 30 реакцій. Усі ці цикли й шляхи між собою пов'язані.

Рис. 15. Взаємозв'язок різних шляхів дисиміляції глюкози.

Пряме окиснення цукрів

У бактерій, грибів, тварин і водоростей виявлено шлях прямого окиснення глюкози без фосфорилювання.

Окиснення глюкози до глюконової килоти здійснюється специфічною ФАД- залежною оксидазою. Глюконова кислота через фосфорилювання і низку перетворень розпадається на тріози, які можуть поступати до інших циклів (цикл Кребса, ПФШ).

Взаємозв'язок різних шляхів дисиміляції глюкози

Біохімічні перетворення при диханні - гліколіз, цикл Кребса, ПФШ, пряме окиснення цукрів - система взаємопов'язаних процесів. На малюнку 1. представлена схема цих взаємозв'язків.

У клітині гліколіз і ПФШ просторово не роз’єднані, мають спільні субстрати. В нормі частка ПФШ у загальному обміні дихання становить приблизно 10-40 % і залежить від типу тканини і її стану.

В анаеробних умовах гліколіз домінує, а в хлоропластах активність апотомічного шляху окиснення вища. Активність ПФШ збільшується і при несприятливих умовах. У цитоплазмі велика частина продуктів ПФШ метаболізується через гліколіз.