БІОТЕХНОЛОГІЯ - В. Г. Герасименко - 2006

Частина ІІ. Спеціальні біотехнології

Розділ 19.БІОТЕХНОЛОГІЇ ОДЕРЖАННЯ L-АМІНОКИСЛОТ

19.3. БІОТЕХНОЛОГІЯ ВИРОБНИЦТВА L-ТРИПТОФАНУ

Вміст триптофану в рослинних білках невеликий. Використовується L-триптофан як кормова добавка до раціонів сільськогосподарських тварин, а високоочищені його препарати з вмістом основної речовини не менше 99 % знайшли застосування в медицині у виробництві компонентів лікувального харчування і в різних біохімічних дослідженнях.

Триптофан одержують як хімічним, так і мікробіологічним синтезом.

Хімічний метод. D, L-триптофан одержують з індола і нітрооцтового ефіру:

При використанні D, L-триптофану, одержаного за цією схемою, у годівлі сільськогосподарських тварин розділення рацемата можна не проводити.

Для розділення рацемічної суміші ацил-D, L-триптофану італійська фірма «Снам Проджетті» використала принципову схему японської фірми «Танабе Сейяку», але аміноацилаза була іммобілізована шляхом включення у порожнисті нитки триацетату целюлози. Активність іммобілізованого ферменту при цьому знижується на 20 %, тобто становить 80 % від розчинного. При використанні 1 кг іммобілізованої аміноацилази одержують 400 кг L-триптофану, вартість якого порівняно з вартістю його виробництва за участю розчинного ферменту становить 60 %.

Мікробний синтез L-триптофану у промислових обсягах здійснюється як за допомогою спороносних штамів-мутантів бактерій Вас.subtilis, недостатніх по тирозину і фенілаланіну (одноступінчастий спосіб), так і шляхом трансформації різних попередників в L-триптофан під дією ферментних систем деяких дріжджів (двоступінчастий спосіб).

Одноступінчастий спосіб включає наступні етапи: культивування вихідного штаму-продуцента, виділення і очищення одержаного триптофану та виробництво на його основі кормових і високоочищених препаратів.

Продуктивність мутанта-продуцента складає до 10 г триптофану в 1 л культуральної рідини.

Кормовий концентрат триптофану (ККТ) одержують без відокремлення біомаси продуцента шляхом вакуум-випарювання культуральної рідини до 30-40 % вмісту сухих речовин з подальшим висушуванням.

Висококонцентровані препарати триптофану одержують з фільтрату культуральної рідини після відділення клітин продуцента. Таким чином одержують технічний препарат триптофану з вмістом амінокислоти до 45 % від вмісту в культуральній рідині. Одержують також високоочищені препарати триптофану з вмістом амінокислоти до 99 %.

Двоступінчастий шлях мікробного синтезу L-триптофану грунтується на проведенні трансформації антранілової кислоти (попередника) під дією ферментних систем Candidia utilis в L-триптофан і одержанні культуральної рідини з вмістом його до 6 г/л.

Крім цього, розроблена технологія виробництва культурального триптофану за допомогою технологій рекомбінантних ДНК. Суть методу полягає в тому, що при конструюванні рекомбінантної (гібридної) ДНК на базі плазміди E.coli, до складу останньої вводиться не один ген, а триптофановий оперон. Його клонування у складі рекомбінантної молекули ДНК, яка складається із фрагменту ДНК з триптофановим опероном і плазмідного вектора E.coli, супроводжується експресією. У триптофановому опероні міститься п’ять генів, що кодують п’ять ферментів, які беруть участь в утворенні з хоризмату (попередника) через такі проміжні сполуки, як антранілат, К-5'-фосфорибозилантранілат, 1-(0-карбоксифеніламіно)-1-дезоксирибулозо-5-фосфат, індол-3-гліцерофосфат, незамінної амінокислоти L-триптофану.

Концентрація ферментів, які кодуються генами триптофанового оперона, що входить до плазмідного вектора Со1Е1, орієнтовно в 20 разів перевищує їхній вміст у звичайних клітинах E.coli. Це пов’язано з тим, що кількість гібридних молекул плазміди Со1Е1 у клітині E.coli може досягати кількох десятків копій.