БІОТЕХНОЛОГІЯ - В. Г. Герасименко - 2006
Частина ІІ. Спеціальні біотехнології
Розділ 7. БІОТЕХНОЛОГІЯ ВИРОБНИЦТВА І ЗАСТОСУВАННЯ ІММОБІЛІЗОВАНИХ ПРЕПАРАТІВ
7.4. НОСІЇ ДЛЯ ІММОБІЛІЗАЦІЇ ФЕРМЕНТІВ
7.4.2.Носії неорганічної природи
Для іммобілізації ферментів використовуються різні неорганічні носії: макропористі кремнеземи — силікагель, силохром, макропористе скло; метали і їх оксиди: титан, залізо, алюміній; природні алюмосилікати — різні глини, цеоліти; пориста кераміка, активоване вугілля, сажа.
Асортимент мінеральних носіїв, які випускаються у різних країнах, постійно збільшується, а стандартизація структурних характеристик носіїв, які виробляються (питома поверхня, розміри і об’єм пор, розміри зерен), роблять їх особливо зручними для використання.
Основними якостями, які обумовлюють широке застосування неорганічних матеріалів як носіїв, є їх здатність до швидкої регенерації і можливість надання їм будь-якої конфігурації. Це перевага мінеральних носіїв. Носії використовуються як у вигляді порошків, гранул, мембран, трубок, кульок, так і моноліту. Вони можуть бути як пористими, так і непористими.
Неорганічні носії можуть використовуватись як для адсорбційної, так і ковалентної іммобілізації після хімічної модифікації поверхні носія шляхом введення реакційноздатних груп, які можуть вступати у взаємодію з функціональними групами ферменту. Найчастіше як модифікуючі агенти використовуються кремнієорганічні речовини, зокрема γ-амінопропілтриетоксісилан, галогенсілани, складні ефіри сілілкарбонових кислот.
Макропористі кремнеземи. До носіїв цього типу належать силікагелі, силохроми і макропористе скло. До позитивних якостей кремнеземних носіїв слід віднести механічну міцність, хімічну інертність до багатьох розчинників, наявність жорсткого каркасу із заданими розмірами пор, стійкість до дії мікроорганізмів.
Силікагель — аморфна речовина із загальною хімічною формулою хSіO2·уН2О. Одержують його в процесі «старіння» (поліконденсації) ортокремнієвої кислоти (SiO2 · 2Η2О):
Поверхня частинок силікагелю й інших кремнеземів покрита гідрофільними гідроксильними групами, які мають слабко- виражені кислотні властивості.
Недоліком кремнеземних носіїв є їх використання в обмеженому діапазоні рН, підвищена розчинність і деяка неспецифічна сорбція на їх поверхні. Подолати ці недоліки, окрім першого, можна шляхом модифікації поверхні кремнеземів.
Модифікація проводиться одним із двох методів. Для зниження розчинності і підвищення стабільності носіїв їх покривають різними матеріалами, наприклад, плівкою оксиду металу (алюмінію, цирконію, титану), полімерів (поліетиленаміну), або обробляють солями перехідних металів.
Можна проводити хімічну модифікацію кремнеземів шляхом введення різних реакційноздатних груп (-CN; -NO2; -NH2 та ін.) або гідрофобізувати поверхню, наприклад хлорангідридами заміщених бензойних кислот або стеароїлхлоридом.
Серед методів хімічної модифікації кремнеземів найбільш розповсюдженими є обробка носія кремнієорганічними речовинами, галогеналкілсиланами, складними ефірами силілкарбо- нових кислот.
Таким чином, використання різних модифікуючих агентів дає можливість змінювати властивості поверхні кремнеземних носіїв. Однак вартість цих носіїв надто висока, а модифікація ще більше підвищує їх вартість, що є суттєвим обмеженням для впровадження кремнеземів у промисловість.
Окрім крупнодисперсних кремнеземів, як носії використовуються і пірогенні кремнеземи. Вони повністю нерозчинні, мають високу хімічну, біологічну і термічну стійкість, жорсткість каркасу при різних значеннях рН розчину. їх поверхня покрита гідроксильними групами, завдяки яким відбувається адсорбція з утворенням водневих зв’язків.
На відміну від крупнодисперсних кремнеземів (силікагелів, силохромів, макропористого скла), які використовуються для іммобілізації біологічно активних речовин з великою молекулярною масою (наприклад, ферментів), пірогенні кремнеземи застосовуються як носії переважно для іммобілізації низькомолекулярних сполук — ліків, гербіцидів.
Аеросил — це тарова марка пірогенного кремнезему, основною речовиною якого є SiO2. Це продукт високотемпературного парафазного гідролізу SiCl4 у струмі кисню з подальшою конденсацією у парах води (І.В. Жарникова, 2004). За фізичними властивостями сорбент є непористим кремнеземом, який має форму частинок, близьких до сферичних. Поверхня аеросилу покрита гідроксильними групами, завдяки яким відбувається адсорбція з утворенням водневих зв’язків. Завдяки своїм фізико-хімічним властивостям (висока чистота, велика питома поверхня, малі розміри частинок), а також у зв’язку з екологічною і фізіологічною нешкідливістю та сумісністю зі шкірою він широко застосовується у фармакології і косметології. Входить до складу наповнювачів пестицидів і добрив, для одержання таблетованих форм лікарських препаратів.
Більш придатними для промислового використання можуть бути природні алюмосилікати — глини, цеоліти, а також пориста кераміка, до складу якої, окрім алюмосилікатів, входять оксиди титану, цирконію або інші домішки. Поверхня цих носіїв аналогічно кремнеземним може бути модифікована різними органічними речовинами, наприклад силанами (γ-амінопропілтриетоксісиланом).
Важливою характеристикою силікатних і алюмосилікатних носіїв є висока щільність поверхневих груп, на яких зв’язування білкових молекул ферменту може здійснюватись як за рахунок електростатичних взаємодій, так і водневих зв’язків. Це дуже суттєво для ефективної іммобілізації ферментів.
Широкого розповсюдження як носії набули також активоване вугілля і графітована сажа. Активоване вугілля може бути використане як носій для адсорбційної і ковалентної іммобілізації (після попередньої активації оксидних груп).
До переваг сажі можна віднести високу однорідність і електричну провідність її поверхні. Остання властивість важлива при створенні біоелектрокаталітичних систем на основі іммобілізованих ферментів. Суттєвим недоліком цього носія є низька механічна міцність, що обмежує його використання. Відкладанням вуглецю на гранульованій сажі був створений новий носій — карбохром, у якого висока механічна міцність поєднується з перевагами графітованої сажі.
Перспективними є носії на основі металів і їх оксидів. Ці носії мають високу механічну міцність, відносно дешеві, стабільні, мають хороші гідродинамічні властивості. На практиці частіше використовуються носії на основі оксиду алюмінію і титану. У промисловому масштабі їх одержують зазвичай у вигляді макропористих порошків, однорідних за формою і розміром. Використання матриць цього типу дозволяє проводити іммобілізацію як адсорбційну, так і ковалентну після попередньої модифікації γ-амінопропілтриетоксісиланом.
Металеві поверхні, які використовуються як носії (Al, Ni, Ti), зазвичай модифікують шляхом створення оксидної плівки на поверхні матриці, або покривають їх шаром полімеру (похідні полістиролу, целюлози та ін.). Це дозволяє значно підвищити місткість носія.
В останні роки розвиваються методи іммобілізації, які грунтуються на використанні носіїв на основі феромагнітних матеріалів. Одержані біокаталізатори й іммобілізовані біологічно активні речовини мають магнітні властивості, що дає змогу маніпулювати ними за допомогою магнітного поля. Іммобілізовані на магнітних носіях лікарські речовини використовуються у системах «направленого транспорту» ліків у органи-мішені, тобто хворі органи. Магнітні носії, з’єднані з біореагентами, є новими засобами виділення і очищення білків і клітин.
За своєю природою магнітні носії можуть складатись із феромагнітного матеріалу або ж бути гелевою субстанцією з включеними в пори частинками магнетика.
Технологія одержання іммобілізованих біологічно активних речовин з магнітними властивостями розвинена у багатьох країнах світу. Препарати біологічно активних речовин з магнітними властивостями, на думку багатьох дослідників, з часом витіснять іммобілізовані біокаталізатори і лікарські засоби.
На основі високодисперсного кремнезему (аеросилу) шляхом додавання до нього магнітного порошку (Fe2O3) одержали біокаталізатор, який в подальшому модифікували декстраном (поліглюкіном) і активували внесенням на поверхню активних груп, що використовуються для ковалентної іммобілізації за схемою (І.В. Жарникова, 2004):
Далі на біокаталізаторі проводили іммобілізацію антитіл з утворенням імуномагносорбента (МІС) з подальшим використанням цього комплексу в імуноферментному аналізі:
Іммобілізовані антитіла зберігають свою стабільну активність і через 9 років зберігання при температурі 4-5 оС, тоді коли зазвичай — тільки 2-3 тижні.
Використання магнітного компонента у складі сорбенту, який використовується як носій у твердофазовому імуноаналізі мікроорганізмів, значно спрощує маніпуляції з дрібнодисперсним матеріалом та підвищує швидкість методу діагностики.