БІОТЕХНОЛОГІЯ - В. Г. Герасименко - 2006

Частина ІІ. Спеціальні біотехнології

РОЗДІЛ 9. ВИКОРИСТАННЯ ІММОБІЛІЗОВАНИХ ФЕРМЕНТІВ У АНАЛІТИЧНІЙ РОБОТІ

Унікальна специфічність дії і висока каталітична активність, а також дедалі більша доступність індивідуальних ферментів стали причиною їх широкого використання для аналітичних цілей, в медицині (гуманній і ветеринарній), харчовій, мікробіологічній і медичній промисловості, для контролю оточуючого середовища і наукових досліджень.

Поряд із вдосконаленням різних фізико-хімічних інструментальних методів (хроматографічних, радіохімічних, люмінесцентних та ін.) методи аналізу з використанням як реагентів ферментів застосовуються для виявлення і кількісного визначення різних речовин: металів, органічних і неорганічних сполук, метаболітів, ферментів, мутагенів, онкогенів тощо.

Особливістю сучасних підходів до створення біохімічних методів аналізу на основі ферментів є високі вимоги до їх чутливості, точності, специфічності, відтворюваності, можливості автоматизації, вартості. Крім того, аналіз має бути експресним, розрахованим на використання мікрокількості зразка і можливість проведення дослідження у багатокомпонентних середовищах, наприклад, таких як сироватка крові, стічні води тощо.

Ще однією характерною рисою сучасного аналізу є його різномасштабність залежно від умов використання: поодиноких у промисловості (1-100 аналізів на день) і масових (10³-10⁴) при епідеміологічних обстеженнях, причому аналізи повинні проводитися як у стаціонарних, так і в пересувних лабораторіях.

Наведені вище вимоги зумовили створення численних видів ферментних аналізаторів.

Однак попри на переваги ферментативних методів аналізу, їх використання донедавна обмежувалося сферою клінічної біохімії. Це пояснюється такими причинами:

1) ферменти - це, у більшості випадків, дуже дорогі препарати, які виділяються із дефіцитної рослинної або тваринної сировини;

2) багато ферментів є нестабільними і швидко втрачають свою каталітичну активність, зберігаються, як правило, при низькій температурі;

3) розчинні ферменти дуже чутливі до дії різних домішок, які можуть міститися в об’єктах, що аналізуються;

4) розчинні ферменти можуть бути використані лише ододноразово, що також підвищує вартість аналізу.

Для широкого впровадження ферментних методів аналізу в медицину (гуманну і ветеринарну), екологію і технологічне виробництво необхідно було вирішити декілька практично важливих завдань: знайти дешевші і доступні джерела ферментів, підвищити стабільність біокаталізаторів, зробити можливим багаторазове використання ферментів. Це досягається методами біотехнології, технічної мікробіології, генної інженерії та інженерної ензимології. Ферменти рослинного і тваринного походження поступово замінюються на мікробні ферменти. Біотехнологи навчились одержувати «на замовлення» такі штами-мутанти, які синтезують необхідний фермент у десятки і сотні разів більших кількостях, ніж вихідні штами.

Принциповим кроком у розвитку ферментативного аналізу було впровадження в аналітичну практику іммобілізованих ферментів, які мають переваги над розчинними формами:

1) багаторазове використання в реакторах періодичної і безперервної дії;

2) висока стабільність при зберіганні і в умовах проходження процесу;

3) знижена чутливість до дії активаторів та інгібіторів, що підвищує специфічність аналізу;

4) простота використання у вигляді готових реагентів;

5) можливість проведення послідовних вимірів з одним і тим самим зразком;

6) зниження вартості аналізу за рахунок вартості самих ферментів, допоміжних реагентів, особливо кофакторів;

7) можливість використання іммобілізованих ферментів у різноманітному обладнанні;

8) скорочення часу аналізів;

9) збільшення рН і температурного оптимуму дії ферментів.

Для іммобілізації ферментів використовують різноманітні типи носіїв, залежно від конструктивних особливостей обладнання. Наприклад, для ферментних електродів використовуються синтетичні полімери, які утворюють плівку з включеними в їхні пори ферментами. Для автоаналізаторів фотометричного типу перспективними виявилися найлонові трубки, на поверхню яких пришиті ферменти. Такі трубки дозволяють проводити з одним зразком до 10000 аналізів (Єгоров А.М., 1984). Для колончастих реакторів ефективні макропористі носії на основі модифікованих кремнеземів.

Перші роботи з аналітичного використання іммобілізованих ферментів належать до середини 60-х років минулого століття. У 1965 р. Дж. Гілболт включив холінестеразу в крохмальний гель, який нанесли на поліуретанову пластинку і використали для виявлення фосфороорганічних пестицидів у повітрі (Березін І.В. та ін., 1987). Іммобілізована холінестераза використовується сьогодні в автоматичних датчиках у промисловому виробництві інсектофунгіцидів для постійного контролю повітряного середовища цехів.

У 1966 р. Г. Хікс і С. Апдайк вперше використали аналітичні колончасті реактори з ферментами, включеними в поліакрі- ламідний гель. За допомогою глюкозооксидази визначали глюкозу, а лактатдегідрогенази - молочну кислоту. Субстрати пропускали через невеликі колонки об’ємом 1-5 мл. Продукт, який утворюється (Н₂О₂ або НАД · Н₂), досліджували колориметрично. З однією колонкою, тобто з однією порцією іммобілізованого ферменту вдавалося провести десятки і навіть сотні аналізів. Відтоді і розпочалась ера іммобілізованих ферментів у хімічному аналізі. Подальший розвиток робіт у цій сфері відбувався за наступними напрямами.