БІОТЕХНОЛОГІЯ - В. Г. Герасименко - 2006

Частина ІІ. Спеціальні біотехнології

РОЗДІЛ 9. ВИКОРИСТАННЯ ІММОБІЛІЗОВАНИХ ФЕРМЕНТІВ У АНАЛІТИЧНІЙ РОБОТІ

9.4.БІОЛЮМІНЕСЦЕНТНИЙ МІКРОАНАЛІЗ

Одним з перспективних методів аналізу є біолюмінесцент- ний метод на основі світлячкової і бактеріальної люциферази.

Під час аналізу реєструється світло, яке випромінюється збудженими продуктами реакції, інтенсивність якого за оптимальних умов проведення процесу пропорційна концентрації таких важливих метаболітів або коферментів, як АТФ, НАД · Н₂, Н₂О₂, гемін, ФМН тощо. Висока специфічність цих реакцій стосовно субстратів, високий квантовий вихід (від 0,01 до 1,0) дозволяє аналізувати багато речовин з межею виявлення до 1 фмоль при використанні поліферментних спряжених (поєднаних) реакцій.

У 1976 р. вперше були одержані препарати іммобілізованої люциферази бактерій. У 1977 р. люциферазу світлячків іммобілізували на скляних кульках і на BrCN-сефарозі. Зі скляних кульок були виготовлені стрижні, за допомогою яких визначали 10^-6 моль/л і більш високі концентрації НАД · Н₂ та АТФ. Згодом як носії використовували діалізні плівки, ацетатцелюлозні мембрани, целюлозу і ін. Іммобілізовані люциферази мають в 10-100 разів вищу стабільність, їх можна використовувати багаторазово для визначення АТФ, НАД · Н₂.

На рис. 9.3 показаний аналізатор з колонним проточним реактором, у якому знаходиться ковалентно іммобілізована люци- фераза на BrCN-сефарозі для визначення концентрації АТФ. Аналогічний реактор з іммобілізованою біферментною системою бактерій дозволяє визначати мікрокількості НАД · Н₂.

Рис. 9.3. Біолюмінісцентний мікроаналіз з колонним реактором

(за Березіним І.В. та ін., 1987):

а — схема установки; 1 — розчин субстрату; 2 — перистальтична помпа;

3 —пристрій для введення зразка, що аналізується; 4 — колонка з іммобілізованою люциферазою в кюветному відділі люмінометра;

5 — реєструючий пристрій (самописець або дисплей).

Біолюмінесцентним методом сьогодні визначаються багато діагностично важливих біохімічних тестів, у яких визначуваною речовиною є АТФ або НАД · Н₂. Наприклад, підвищення в сироватці крові активності креатинкінази спостерігається при таких важких захворюваннях, як інфаркт міокарда, інсульт або мускульна дистрофія. Біолюмінесцентний метод дозволяє встановити активність цього ферменту від 0,1 до 1000 МО (в нормі сироватка містить менше 10 МО креатинкінази). Ферментативний метод аналізу креатинкінази заснований на таких реакціях:

Наприкинці кінці ХХ століття з’явилося чималоо робіт з використання в мікроаналізі соіммобілізованих поліферментних біолюмінесцентних систем. Наприклад, за допомогою три- ферментної соіммобілізованої системи: аденілаткіназа + піруваткіназа + люцифераза світлячків визначають різні аденінові нуклеотиди: АМФ, АДФ і АТФ таким чином:

Потім АТФ вимірюють люциферазою світлячків. При аналізі АДФ, окрім люциферину, беруть субстрат піруваткінази - фосфоенолпіруват, а для визначення АМФ у реакційну суміш вводять цитидинтрифосфат (ЦТФ). Отже, один біокаталізатор, що містить три співіммобілізованих ферменти, використовується для визначення трьох нуклеотидів.

Триферментна система: бактеріальна люцифераза + оксидоредуктаза + форміатдегідрогеназа, що співіммобілізовані на BrCN-сефарозі, використовуються для визначення НАД в інтервалі концентрації 10^-12—10^-6 моль/л і форміату з межею виявлення 10^-12 моль/л. У цьому випадку НАД перетворюється за реакцією:

який вимірюється біолюмінесцентно.

Великою перевагою співіммобілізованих поліферментних систем є те, що активність співіммобілізованих ферментів зростає у десятки, а іноді в сотні разів порівняно з їх розчинними формами. Певно, при співіммобілізації досягається значно вища локальна концентрація ферментів і продуктів проміжних реакцій на поверхні носія, полегшується дифузія продуктів однієї ферментативної реакції до активного центру іншого ферменту.

Сьогодні 4-, 7- і навіть 13-ферментні співіммобілізовані системи використовуються для біолюмінесцентного мікроаналізу різних метаболітів: стероїдів, тригліцеридів, жовчних кислот тощо.