БІОТЕХНОЛОГІЯ - В. Г. Герасименко - 2006

Частина ІІ. Спеціальні біотехнології

Розділ 14.БІОТЕХНОЛОГІЯ ОДЕРЖАННЯ МОНОКЛОНАЛЬНИХ АНТИТІЛ (АНТИТІЛ ОДНОГО ЕПІТОПУ)

14.2.МОНОКЛОНАЛЬНІ АНТИТІЛА І ГІБРИДОМНА ТЕХНОЛОГІЯ

Традиційним способом практично неможливо одержати моноспецифічні або моноклональні антитіла. Для цього необхідно розділити суміш антитіл або В-лімфоцити на окремі види.

Для одержання моноклональних антитіл проти певного епітопу антигену після імунізації тварини необхідно відповідну антитілоутворюючу плазматичну клітину ізолювати, а потім розмножити її за межами організму в клітинній культурі. Але перешкодою є нездатність плазматичних клітин, які виробляють антитіла, до розмноження і тривалого життя поза організмом, в умовах клітинної культури через генетично обумовлену обмеженість кількості поділів (50-100 поділів і клітина гине). Подолати цю перешкоду вдалося шляхом створення гібридної клітини (гібридоми), яка утворює певні антитіла.

Вчені звернули увагу на те, що клітини злоякісних пухлин кісткового мозку (мієлом) продукують величезну кількість аномальних імуноглобулінів (антитіл). Ці клітини мають здатність до необмеженого росту (тобто утворюють клони) і продуковані ними імуноглобуліни ідентичні за структурою. По суті це моно- клональні антитіла, однак антиген, проти якого вони виробляються, невідомий.

Одержання гібридом. Спосіб одержання гібридом розроблено вченими Г. Келером і Ц. Мільстейном у Великій Британії в 1975 р. Перш ніж опублікувати результати досліджень, вони звернулися до британського уряду з пропозицією запатентувати гібридомні технології, але отримали відмову. Після цього результати були опубліковані у журналі Nature, а Велика Британія втратила право на відкриття, яке було визнане одним із найважливіших у період з 1970 по 1980 роки.

Вченим удалося одержати в умовах пробірки гібридому шляхом злиття клітин мієломи і антитілоутворюючих клітин (лімфоцитів) селезінки миші, імунізованої еритроцитами барана. Точність щодо кількості клітин мієломи не дуже важлива і їх співвідношення з клітинами селезінки може коливатися від 1:10 до 1:1. Гібридизація клітин здійснюється за допомогою поліетиленгліколю, який розчиняє оболонки клітин. Утворена гібридна клітина успадкувала від батьківських клітин їх корисні властивості. Як і вихідні лімфоцити, вона синтезує антитіла, а подібно до пухлинних клітин має здатність до практично нескінченного розмноження у клітинній культурі.

Заслуга Келера і Мільстейна полягає в тому, що вони примусили індивідуальну В-клітину (В-лімфоцит) виробляти антитіла поза організмом, в умовах культури клітин. Такі антитіла одержали назву моноклональних через те, що вони синтезуються нащадками однієї В-клітини, яка стала «безсмертною» завдяки гібридизації з пухлинною мієломною клітиною.

Донедавна для гібридизації використовували мієломні клітини і В-лімфоцити мишей і щурів. Продуковані ними моноклональні антитіла мають обмежене терапевтичне застосування, тому що вони є чужорідним білком для людського організму. На сьогодні одержані гібридоми на основі імунних клітин людини і відповідні моноклональні антитіла. Але гібридоми людини ростуть повільно, досить нестабільні і в деяких випадках теж викликають імунні реакції. Проте людські моноклональні антитіла мають здатність розпізнавати тонкі відмінності в структурі антигену, які не розпізнаються моноклональними антитілами миші або щура.

Для збереження одержаних гібридних клітин широко застосовується метод глибинного заморожування, завдяки чому став можливий обмін гібридомами, отриманих у різних лабораторіях світу, а також створення банків гібридом для наукової мети.

Гібридомна технологія відкрила нову еру в імунології, а робота Келера і Мільстейна була удостоєна Нобелівської премії. Нині на будь-який агент можна одержати гібридоми у необхідній кількості. Гібридомна технологія перетворилася в одну із найбільш розвинених галузей біотехнології.

Одержання моноклональних антитіл. Моноклональні антитіла - це однорідні за хімічним складом, структурою і специфічністю антитіла, синтез яких здійснюється в клонованих гібридних клітинах (гібридомах).

Технологія одержання моноклональних антитіл включає такі етапи: І - імунізація тварин; ІІ - гібридизація, підготовка клітин до злиття (фузії) та злиття; ІІІ - селекція - відбір гібридом, які утворюють антитіла потрібної специфічності; IV - клонування гібридомних клітин; V - культивування - одержання культуральної рідини або асциту, які містять антитіла, і виділення антитіл (рис. 14.1). Вся процедура від початку імунізації тварин до виділення антитіл триває в середньому 3-4 місяці.

Рис. 14.1. Схема одержання моноклопальних антитіл за допомогою гібридомної технології (за Єліновим Н.П., 1995):

A3 — агент злиття клітин; 1 — В — клітини із селезінки імунної миші;

2 — культура мієломних клітин миші; 3 — гібридизація; 4 — гібридоми;

5 — селекція і клонування гібридом; 6 — гібридоми, які утворюють моноклональні антитіла; 7 — введення гібридом, які утворюють моноклональні антитіла, в організм сингенної миші; 8 — клітини гібридоми, що утворюють моноклональні антитіла, які культивуються в культурі тканини; 9 — вирощування гібридомних клітин, що утворюють моноклональні антитіла, у ферментері; Igкр — імуноглобуліни в культуральній рідині; ig ас — імуноглобуліни в асцитній рідині;

10 — висолювання Ig-ів сульфатом амонію; 11 — стандартизація Ig-ів;

12 — ліофілізація Ig-ів.

Біотехнологія виробництва моноклональних антитіл гарантує елімінацію пухлинних клітин, що не злилися, а також гібридів, утворених злиттям мієломних клітин і В-лімфоцитів.

На першому етапі здійснюється імунізація тварин антигеном певного епітопу. Потім із суспензії клітин селезінки тварини виділяється відповідна антитілоутворююча клітина (АУК) та проводиться підготовка мієломних клітин.

Для гібридизації використовуються в основному мієломні клітини миші і щура, а останнім часом з’явилися повідомолення про використання мієломних клітин людини. Мієломні клітини мають бути генетично марковані так, щоб вони гинули на певному селективному середовищі.

При одержанні перших гібридом Г. Келер і Ц. Мільстейн партнерами для злиття вибрали клітини селезінки мишей, імунізованих еритроцитами барана, і клітини мієломної лінії РЗ, які адаптовані до росту в культурі. Клітини цієї лінії, на відміну від нормальних лімфоцитів, не могли засвоювати гіпоксантин із поживного середовища через відсутність ферменту пуринового

обміну гіпоксантин-гуанін-фосфорибозилтрансферази (ГГФРТ). Це було використано як селективний фактор при відокремленні пухлинних клітин, які не злилися з лімфоцитами, від утворених гібридом. Пухлинні клітини гинуть, а гібридоми, які одержали здатність засвоювати гіпоксантин від нормальних лімфоцитів, виживають. Антитілоутворюючі клітини селезінки, що не брали участі в утворенні гібридом, живуть в культурі всього декілька днів і теж гинуть. В культурі залишаються гібридоми, і ті, які вижили, перевіряються на здатність синтезувати антитіла певної специфічності, а потім настає найбільш відповідальний етап роботи — клонування. Необхідно виростити з однієї клітини життєздатну популяцію гібридом (клон), які секретують антитіла необхідної специфічності. Зазвичай необхідну гібридому вдається відшукати серед тисячі до неї подібних.

Культивування виділеного клону (одержання масової культури) проводиться наступними методами:

1) у культурі тканини - найкращий спосіб, тому що виділені імуноглобуліни мають високу чистоту;

2) в організмі сингенних тварин (мишей, щурів) - у вигляді асцитної пухлини після введення гібридомної клітинної зависі в черевну порожнину;

3) у ферментерах (суспензійна культура).

Асцитна пухлина — це злоякісна пухлина черевної порожнини мишей у вигляді клітин, які знаходяться у зависі внутрішньочеревної рідини. Титр моноклональних антитіл в асцитній рідині на 2-3 порядки перевищує ту кількість, яка міститься у культуральному середовищі. Проте добування моноклональних антитіл в умовах клітинної культури має переваги, обумовлені більш сприятливими умовами контролю процесу біосинтезу антитіл, виділенням антитіл із культурального середовища і наступним їх очищенням.

Переведення гібридних клітин у великі об’єми середовища при масштабному культивуванні супроводжується великими труднощами, бо не кожен їхній клон виживає за таких умов. Тому на практиці проводиться розведення «маточних» клітин поступово, спочатку 1:2-1:3, а потім і більше, використовуючи спеціальні культиватори (рис. 14.2).

Рис. 14.2. Культиватор гібридомних клітин (загальний вигляд) фірми IBF biotechnics (за Єліновим Н.П., 1995)

Для вирощування гібридом у суспензійних культурах дуже важливим є застосування спеціальних безсироваткових середовищ. Фірма Sigma (США) випустила у продаж таке середовище (в сухому/рідкому стані) під назвою Hybry-Max, що не має сироватки і білків. Усього в середовищі міститься 82 компоненти (22 амінокислоти, 12 вітамінів, 27 неорганічних речовин і 21 - решта сполук). Це амінокислоти, вітаміни, нуклеотидні попередники, глюкоза, ліпіди, прогестерон, неорганічні солі і мікроелементи. Це середовище рекомендовано для злиття, клонування, вирощування гібридомних і мієлоїдних клітин, а також для підтримки на відповідному рівні продукції антитіл.

Моноклональні антитіла мають величезні переваги над звичайними імунними сироватками, оскільки забезпечують унікальну специфічність, стандартність і високу точність досліджень, підвищують їх дозвільну спроможність та інформативність.

Один із суттєвих недоліків звичайних антисироваток є їх нестандартність. Від однієї тварини не можна одержати такої кількості антисироватки, якої б вистачило для тривалого використання, а різні тварини через індивідуальні відмінності синтезують до одного й того самого антигену різні за специфічністю і спектром гетерогенності антитіла. Гібридоми ж продукують необмежену кількість препарату з абсолютно стандартними властивостями, тому що хімічна гомогенність моноклональних антитіл не змінюється у процесі їх виробництва стабільним гібридомним клоном. Крім того, у звичайній антисироватці специфічні антитіла становлять у кращому випадку, 1-5 % від загальної кількості сироваткових білків. Решта — це баластні речовини, введення яких в організм часто призводить до небажаних наслідків. При використанні моноклональних антитіл в організм вводиться невелика кількість чистого препарату, достатнього для потрібного ефекту, але без побічних явищ.

Поряд з безперечними перевагами моноклональні антитіла мають і недоліки, які створюють проблеми при їх практичному використанні. Вони нестабільні при зберіганні у висушеному стані, тоді як у суміші звичайних (поліклональних) антитіл завжди присутня група антитіл, стійких за вибраних умов зберігання. Отже, неоднорідність звичайних антитіл дає їм додатковий резерв стабільності при зміні зовнішніх умов, що відповідає одному з основних принципів надійності систем.

Моноклональні антитіла нерідко мають дуже низьку спорідненість з антигеном і надмірно вузьку специфічність. Це перешкоджає їх застосуванню проти мінливих антигенів, що характерно для інфекційних агентів і пухлинних клітин. Крім того, моноклональні антитіла на світовому ринку мають дуже високу вартість.