БІОТЕХНОЛОГІЯ - Іншина Н.М. - 2009

РОЗДІЛ 1. ГЕННА ІНЖЕНЕРІЯ

Методи введення рекомбінантної ДНК у клітини

Існують 4 групи методів уведення рекомбінантної ДНК:

— хімічні (використання лїпосом, іонів металів та інших хімічних реагентів);

- фізичні (електроиорацїя, лазерне опромінення);

— механічні (мікроін’єкція, балістична трансформація);

- біологічні методи (перенесення генів у процесі вірусної інфекції трансфекція).

Процес поглинання клітинами екзогенної ДНК називається трансформацією.

Ефективність трансформації визначають як число трансформантів на 1 мкг уведеної ДНК. Сучасні методи трансформації бактеріальних клітин дозволяють одержати до 10⁷ - 10⁸трансформантів на 1 мкг плазмідної ДНК.

Клітини, що здагні поглинати чужорідну ДНК, називають компетентними. Кількість компетентних клітин можна збільшити, використовуючи спеціальне поживне середовище або умови культивування.

Частоту трансформації і трансфекції клітин Е.соlі можна підвищити різними способами: тепловий шок, дія іонів металів (Са²⁺, Rb⁺).

Якщо клітини Е.соlі обробити СаСl₂ за температури 0 С, а потім підвищити температуру до 42°С і витримувати протягом 1,5 хв, відбувається локальне пошкодження клітинної стінки. Цей метод забезпечує частоту трансформації 10³ (на 1000 клітин 1 трансформована).

Для введення рекомбінантної ДНК у клітини тварин і людини використовують ліпосоми. Ліпосоми проникають усередину клітин шляхом ендоцитозу.

Електропорація (короткочасний вплив електричного поля протягом 10 мікроксекунд 100 мілісекунд) дозволяє одержати 10⁹ — 10¹⁰ трансформантів на 1 мкг ДНК. Під дією електричного струму збільшується проникність клітинних мембран. Едектропорацію використовують для введення в Е.соlі бактеріальних штучних хромосом. Умови проведення електропораци для різних бактерій відрізняються. Ефективність

трансформації для коротких плазмід становить 10⁹, а для довгих (135 тис. п. н.) — 10⁶.

Лазерне опромінення застосовують для створення мініпор (діаметр 2-120 нм) у мембранах клітин-реципієнтів рекомбінантної ДНК.

Мікроін’єкції рекомбінантної ДНК здійснюють за допомогою мікроманіпуляторів, оснащених скляними мікрокапілярами, якими проколюють мембрани клітин. Цей метод інтенсивно застосовується під час створення трансгенних тварин. Великі фрагменти ДНК уводять безпосередньо в ядра клітин. З усіх методів трансформації лише мsкроін’єкція дозволяє вводити в клітини дозовану кількість молекул ДНК.

Бомбардування клітин мікрочастинками вольфраму, золота або льоду, на поверхні яких міститься рекомбінантна ДНК, називають балістичною трансформацією. Цей метод дозволяє вводити ДНК не лише в ядра, а й у мітохондрії і хлоропласти. Балістична трансформація використовується в генотерапії, для імунізації організму за допомогою ДНК-вакцин, а також для одержання трансгенних рослин і тварин.

Найчастіше в генній інженерії застосовуються біологічні методи введення рекомбінантної ДНК, за яких перенесення генів здійснюється у процесі вірусної інфекції.

Для ідентифікації трансформованих клітин використовують такі методи;

- тестування на резистентність до певних антибіотиків;

- гібридизація із зондом, комплементарним певній ділянці необхідного гена;

- імунологічні тести, виявлення специфічного білка - продукту клонованого гена.

Для перевірки експресії вбудованих генів використовують так звані репортні ієни, продукти експресії яких легко виявити. Найчастіше як репортні гени використовують ген зеленого флуоресцентного білка (GFP) або ген β-галактозидази. β-галактозидаза розщеплює штучний субстрат Xgal (5-бром-4-хлор-3-індоліл-D-галактопіранозид) з утворенням продукту реакції блакитного кольору. Бактеріальні колонії, що містять рекомбінантні плазміди з геном β-галактозидази, забарвлені у блакитний колір.