БІОТЕХНОЛОГІЯ - Іншина Н.М. - 2009

РОЗДІЛ 1. ГЕННА ІНЖЕНЕРІЯ

Клонування генів. Клонотеки генів

Клоном називають сукупність ідентичних копій, утворених з одного попередника. Клони генів використовують для вивчення їх структури.

Суть клонування полягає у введенні ділянки ДНК у бактеріальну клітину, де вона pen лікується. Одна клітина забезпечує утворення колонії, яка містить велику кількість ідентичних клітин: наприклад, під час вирощування на агарі за одну ніч клітина Е.соlі утворює 10⁷ клітин в одній колонії. Отже, за допомогою бактеріальних клітин забезпечується синтез значної кількості копій необхідних генів.

Етапи клонування генів:

- розщеплення ДНК рестриктазами;

- обробка рестриктазами вектора для клонування;

- з’єднання двох фрагментів ДНК за допомогою ДНК-лігази фага Т₄;

- трансформація клітин-реципієнтів;

- ампліфікація ДНК у трансформованих клітинах.

Клонотека генів — це набір різних послідовностей нуклеотидів ДНК, планованих у складі векторних молекул, які в сумі утворюють увесь геном організму.

Для створення клонотеки генів рекомбінантну ДНК упаковують у фати та інфікують ними бактерії. Чим коротші фрагменти ДНК для клонотек генів і чим складніший досліджуваний геном, тим більшу кількість клонів необхідно одержати, щоб клонотека була повною. Наприклад, щоб створити геномну клонотеку із фрагментів ДНК довжиною 20 тис. п. н. (будь-яка послідовність представлена з вірогідністю 99%), для бактерій необхідно мати 460 клонів, для ссавців — 600 000, для покритонасінних рослин - кілька мільйонів.

Розмір клонотеки, що містить з необхідною вірогідністю будь-яку послідовність генома, можна обчислити за формулою:

де N - кількість необхідних клонів;

Р — вірогідність того, що клонотека містить необхідну послідовність

ДНК;

f — частка генома, представлена в кожному клоні (розраховується як відношення середнього розміру вставки до розміру генома).

Клонотеки, одержані з використанням бактеріальних клітин, зберігають за температури -70°С у вигляді суспензії у 30% розчині гліцєролу, а суспензії фагових частинок - у диметилеульфоксиді. Це запобігає руйнуванню клітин бактерій і фагів під час заморожування і відтавання.