БІОТЕХНОЛОГІЯ - Іншина Н.М. - 2009

РОЗДІЛ 1. ГЕННА ІНЖЕНЕРІЯ

Системи експресії рекомбінантних генів

У процесі використання систем експресії рекомбінантних генів ураховують такі їх найважливіші молекулярно-біологічні особливості:

- тип промотору і термінатора транскрипції;

- міцність зв’язування мРНК з рибосомою;

- число копій клонованого гена і його локалізація (у плазміді або у хромосомі клітини-хазяїна);

- локалізація синтезованого продукту;

- ефективність трансляції в організмі хазяїна;

- стабільність продукту в клітині-хазяїні.

Як системи експресії рекомбінантних білків застосовуються клітини бактерій, дріжджів, культури еукаріотичних клітин, позаклітинні білоксинтезуючі системи, проточні системи.

Бактерії Е.соlі синтезують велику кількість ферментів (гідролаз), мають високоефективні механізми для фолдинга і секреції ферментів. Проте в бактеріальних клітинах відсутні системи постгрансляцїйних модифікацій білків, тому в них не можуть бути одержані біологічно повноцінні білки еукаріот. Відомо більш ніж 500 посггрансляційних змін білків, основними з яких є такі:

- утворення дисульфідних зв’язків;

- частковий протеоліз - видалення пептиду з N-кінця білкової молекули з утворенням активного білка;

- глікозилювання приєднання специфічного вуглеводного залишку;

- модифікація амінокислот у складі білка (фосфорилювання, ацетилювання, карбоксилювання, сульфування).

Прокаріоти не можуть здійснювати глікозилювання і модифікацію специфічних амінокислот. У зв’язку з цим для синтезу білків людини переважно використовують клітини еукаріот.

Клітини дріжджів Saccharomyces cerevisiae використовуються для синтезу білків людини, тварин і рослин. За допомогою метилотрофних дріжджів Pichia pastoris, для яких джерелом Карбону є метанол, одержують понад 300 рекомбінантних білків. Уперше для синтезу білків людини і тварин метилотрофні дріжджі почали використовувати у 1984 р.

Культури клітин, що застосовуються для синтезу рекомбінантних білків:

- клітини яєчників китайських хом’ячків (лінія СНО);

- клітини мієломи мишей (лінія SP 210);

- клітини селезінки мишей (лінія MEL);

- клітини африканської зеленої мартишки (лінія COS);

- клітини комах, інфіковані бакуловsрусами.

Особливістю клітин комах є здатність здійснювати постгрансляційні модифікації білків, але вони дещо відмінні від, модифікацій у клітинах ссавців. Найчастіше використовуються клітинні лінії IPLB-Sf-21-AE із Spodoptera frugiperda і BTI-TN-5B1 -4 з Trichopsulanі.

Порівняння бактерій, клітин дріжджів, комах, ссавців, людини, трансгенних рослин і тварин як систем експресії рекомбінантних генів подано у табл. 1.2.

Таблиця 1.2

Можливості виробництва людських білків на основі технології

рекомбінантної ДНК

Спосіб виробництва	Сучасний стан	Переваги	Недоліки
У бактеріях	Методи первинного виробництва	Бактерії легко вирощувати в культурі	Відсутня посттрансляційна модифікація білків
У клітинах дріжджів	Широко застосовується	Білки синтезуються у формі, ближчій до людської	Важче культивувати, ніж бактерії. Для одержання білка клітини дріжджів необхідно зруйнувати
У клітинах ссавців	Використовують гібридоми	Білки синтезуються у формі, найближчій до людської	Важко вирощувати клітини у культурі; можливе забруднення вірусами або пріонами
У клітинах людини	Зриває розробка	Білки синтезуються у необхідній для людей формі	Високий ризик забруднення вірусами і пріонами; необхідна генно-інженерна модифікація клітин, що забезпечує можливість їх культивування
У клітинах комах	Триває розробка	Висока швидкість виробництва	Триває розробка методів культивування клітин комах
У трансгенних тваринах	Продукти синтезу поки що не застосовуються у медицині	Невисока собівартість порівняно з методом культури клітин	Повільний ріст тварин; можливий негативний вплив препаратів на організм тварин; можливе забруднення вірусами або пріонами
В яйцях трансгенних курей	Ранні стадії розробки	Швидкий ріст і розвиток курей; легко одержувати рекомбінантний білок; кури захищені від дії препаратів	Триває розробка технологій одержання трансгенних яєць
У трансгенних рослинах	Деякі продукти використовуються для лікування, інші проходять розробку	Невисока собівартість; препарати нетоксичні для рослин	Можлива міграція трансгенів у дикі популяції

Клітини з порушеною проникністю зовнішніх мембран

За механізмом дії і властивостями ці клітини займають проміжне положення між системами трансляції живих клітин і позаклітинними білоксинтезуючими системами. Для одержання клітин з порушеною проникністю мембран клітини тварин вирощують у культурі й обробляють детергентом дигітоніном. Клітини з напівпроникними мембранами використовуються для дослідження процесів секреції білків.

Позаклітинні білоксинтезуючі системи використовуються для дослідження механізмів експресії клонованих генів in vitro, одержання рекомбіцантних білків. Перевагою цих систем є доступність їх окремих компонентів для експериментальної дії. Позаклітинні білоксинтезуючі системи дозволяють вивчати вилив різних екзогенних факторів (pH, активатори, інгібітори) на їх функціонування.

Розрізняють 2 типи позаклітинних білоксинтезуючих систем:

І) прокаріотичні системи (на основі екстрактів клітин Е.соlі) містять такі компоненти: рибосоми, фактори трансляції, мРНК, тРНК, амінокислоти, ГТФ, K⁺/NH₄⁺, Mg²⁺/Ca²⁺, буфери;

2) еукаріотичні системи одержують із ретикулоцитів кролів, зародків пшениці (тривале зберігання), соматичних клітин різного походження.

Позаклітинні системи існують короткий час (40-60 хв) і забезпечують малий вихід синтезованого білка (1 мкг / 1 мл екстракту), на 1 молекулу мРНК синтезуються 1-2 молекули поліпептиду.

Проточні системи

У 1988 р. російський учений О.С. Спірін розробив ефективну проточну білоксинтезуючу систему. Екстракти бактеріальних або еукаріотичних клітин поміщають в ячейку, оточену з обох боків напівпроникними мембранами. Розмір пор дозволяє проходити через мембрани низькомолекулярним речовинам і невеликим за розміром білкам. Вміст ячейки з компонентами для безклітинної трансляції інкубують за звичайної температури. Причому, з одного боку у таку ячейку-реактор зі швидкістю 1 мл/год неперервно надходять інгредієнти, що використовуються під час біосинтезу білка (амінокислота, АТФ, ГТФ), а з другого — із неї виходять синтезовані білкові продукти.

У проточних системах біосинтез білка може здійснюватися неперервно протягом кількох годин. Ефективність трансляції досить висока: на одну молекулу мРНК синтезуються сотні копій полі пептид них ланцюгів. Сумарний вихід рекомбінантного білка становить 200 мкг і більше на 1 мл екстракту.

За допомогою проточних білоксинтезуючих систем стало можливим здійснювати біосинтез рекомбінантних білків у препаративних кількостях in vitro. Така система дозволяє синтезувати поліпептиди, що підлягають швидкій внутрішньоклітинній деградації протеїназами, або білки з цитотоксичною активністю. У проточних системах можна одержувати препаративні кількості функціонально активного інтєрлейкіна-6 людини.