БІОТЕХНОЛОГІЯ - Іншина Н.М. - 2009

РОЗДІЛ 1. ГЕННА ІНЖЕНЕРІЯ

Методи секвенувания ДНК

Процес визначення нуклеотидної послідовності фрагмента ДНК називають секвенуванням.

Найпоширенішим методом секвенування є дидєзоксинуклеотидний. Назва методу походить від терміна «дидезоксинуклеотид».

Дидезоксинуклеотид — дезоксинуклеотид, позбавлений 2’- і

3’-гілоокисльних груп у молекулі рибози.

Відомо, що синтез ДНК відбувається за рахунок приєднання нуклеозидтрифосфату до 3’-ОН-групи нуклеотида. Приєднання дидезоксинуклеотида зупиняє процес нарощення полінуклеотидного ланцюга, оскільки дидезоксинуклеотид не містить 3’-ОН-групи.

Для секвенувания в різних пробірках одночасно проводять 4 реакції синтезу ДНК на матриці, послідовність нуклеотидів якої визначають. Кожна реакція здійснюється у присутності одного із 4-х дидезоксинуклеотидів. Інкубація призначеної для секвенувания одноланцюгової ДНК із праймером, ДНК-полімеразою I, dАТФ, dГТФ, dЦТФ, dПТФ забезпечує копіювання фрагмента ДНК. Один із трифосфатів повинен бути радіоактивним, синтезовані ДНК є міченими. В кожній з пробірок синтезується унікальний набір олігонуклеотидів.

Для розділення молекул ДНК використовують електрофорез: молекули ДНК рукаються в електричному полі вздовж пластини поліакриламідного гелю зі швидкістю, залежною від довжини ланцюга — чим коротший ланцюг ДНК, тим швидше він рухається. Кожне приєднання нуклеотида змінює рухливість ланцюга. Ланцюгам з різною рухливістю відповідають полоси, які ідентифікують за допомогою радіоавтографії.

За допомогою спеціальних приладів (секвенаторів) процес секвенування ДНК здійснюють автоматично.

Секвенування довгих нуклеотидпих послідовностей

За допомогою праймера і дидезоксиметоду секвенують перші 250 - 300 нуклеагидів. За результатами секвенування синтезують другий праймер і визначають послідовність наступних 250 -300 нуклеотидів. Цей метод називається «праймєр-опосерєдкованою прогулянкою» або «блукаючою затравкого». Метод дозволяє секвенувати дуже довгі фрагменти ДНК.

Новий метод секвенування ДНК

Професор О. Аксиментьєв і його колеги розробили пристрій, що здатний записувати послідовності нуклеотидів у міру проходження молекули ДНК через нанопору у кремнієвому мікрочипі. В електричному полі молекула ДНК здатна проходити через пори діаметром 2 нм. Під час руху молекули ДНК через нанопори її електричне поле індукує специфічні електростатичні потенціали, що можуть бути зафіксовані і розшифровані.

Цей метод дозволяє вивчати механічні властивості ДНК і здійснювати швидке і точне секвенування геномів. Як відомо, секвенування генома людини має високу собівартість. Вартість секвенування генома людини з використанням методу Аксиментьєва становить 1000 доларів.