БІОТЕХНОЛОГІЯ - Іншина Н.М. - 2009

РОЗДІЛ 2. БІЛКОВА ІНЖЕНЕРІЯ

Сучасні досягнення білкової інженерії. Зміна властивостей ферментів

Використання хімічних методів для направленої зміни властивостей ферментів розпочалося у 1966 р. з праць Л. Полгара і М. Бендера, а також К. Нііта і Д. Кошланда, які в активному центрі субтилізна залишок серину замінили на цистеїн (хімічний мутагенез на рівні білкової молекули).

У 80-х роках XX ст. Е. Кайзер приєднав флавіновий кофермент до папаїну, що супроводжувалося перетворенням протеїнази в оксидоредуктазу.

З метою підвищення стабілізації молекул ферментів здійснюють заміну одних амінокислот на інші. Наприклад, термостабільність тріозофосфатізомерази вдалося підвищити шляхом заміни амінокислот у двох положеннях. Досить часто замінюють аспарагін і глутамін на інші амінокислоти. Це пов’язано з тим, що за високих температур залишки

аспарагіну і глутаміну підлягають дезамінуванню з утворенням аміаку, аспарагінової і глутамінової кислот, що призводить до втрати конформації поліпептидного ланцюга й активності ферментів.

Як відомо, тривалість напівжиття білків-ферментів становить від кількох хвилин до кількох годин. Така варіабельність пов’язана із відмінностями в кількості дисульфідних зв’язків у білковій молекулі і наявністю або відсутністю на N-кінці молекули певних амінокислот. Наприклад, якщо до N-кінця молекули ферменту β-галактозидази приєднати різні амінокислоти, то тривалість існування модифікованого білка in vitro може змінитися від 2 хв до 20 год. (табл. 2.1).

Таблиця 2.1

Період напівжиття β-галактозидаз, що містять на N-кінці різні амінокислоти

Амінокислоти, що подовжують тривалість життя білків, можна вбудовувати у білки генно-інженерними методами. Введення в білки додаткових амінокислотних залишків приводить до їх стабілізації. Наприклад, уведення кількох амінокислотних залишків у поліпептидний ланцюг протеїнази Bacillus stearothermophilus приводить до підвищення активності фермешу у 340 разів за температури 100 С.

На сьогодні ковалентні і нековапентні хімічні модифікації білків є поширеним підходом до зміни їх властивостей.

Існують три сучасних підходи до покращання властивостей ферментів.

1. Хімічні модифікації.

Хімічні модифікації — це група методів стабілізації ферментів і зміни їх субстратної специфічності шляхом уведення невеликих функціональних груп. Ковалентна модифікація ферментів багатофункціональними реагентами використовується для введення в білки нових функціональних груп, підвищення їх розчинності в органічних розчинниках і зміни інших біохімічних властивостей. Використовуючи модифікацію ферментів поліетиленгліколем, можна збільшити їх тривалість напівжиття і знизити антигенність. Хімічні модифікації дозволяють підвищувати стабільність й активність ферментів, змінювати їх специфічність. Недоліком цих методів є неможливість здійснення контролю за повнотою проходження реакцій.

2. Стабілізація ферментів для функціонування в органічних розчинниках.

Властивості ферментів як біокаталізаторів не залежать від природи органічних розчинників, оскільки в органічному середовищі структура активного центру не змінюється. В органічних розчинниках ферменти зберігають свої основні характеристики, а у водних розчинах - ні. Для використання ферментів в органічному середовищі необхідно їх кристалізувати.

Використання органічних розчинників замість води як середовища для проведення хімічних реакцій на основі біокаталізу має низку переваг: підвищення розчинності гідрофобних субстратів, зміщення рівноваги хімічної реакції в напрямку утворення продуктів реакції.

3. Молекулярний імпринтинг — це штучне створення гібридних білків із фрагментів природних білків різного походження.

Сучасні методи генної і білкової інженерії дозволяють уводити в поліпептиди* ланцюга елементи вторинної структури інших білків, вбудовувати нові функціональні домени, а також об’єднувати цілі білкові молекули в одному поліпептидному ланцюгу.

Метою конструювання гібридних білків є покращання властивостей вихідних молекул для продуктивнішого їх використання, створення білків і ферментів з новими властивостями. Дослідження в галузі гібридних білків спрямовані на зміну кінетичних параметрів ферментів, їх субстратної специфічності, оптимуму pH, термостабільності, а також створення біфункціональних і багатофункціональних білкових молекул.

Створення гібридних білків є різновидом раціонального редизайну білкових молекул. Наприкінці 80-х років XX ст. створено біфункціональні ферменти, які у складі одного поліпептидного ланцюга об’єднують різні ферменти: β-галактозидазу і галактозодегідрогеназу, мапатдегідрогеназу і цитратсинтазу. Встановлено, що сумарна активність таких систем у 2 — 3 рази вища, ніж активність сумішей окремих ферментів. Створюються нові гібридні мультифермєнтні комплекси.