Молекулярная биотехнология. Принципы и применение - Глик Б., Пастернак Дж. 2002

Основы молекулярной биотехнологии
ДНК, РНК и синтез белка
Трансляция

Трансляция осуществляется при участии мРНК, разных тРНК, «нагруженных» соответствующими аминокислотами, рибосом и множества белковых факторов, обеспечивающих инициацию, элонгацию и терминацию синтеза полипептидной цепи. Трансляция в прокариотических клетках инициируется формилметиониновой тРНК, которая так и называется — инициаторная тРНК. При участии белковых факторов антикодон 3'-UAC-5' инициаторной тРНKfMet (fMet — модифицированный метионин, аминогруппа которого формилирована) связывается с кодоном 5-AUG-3' мРНК, образующей комплекс с малой рибосомной субъединицей. Никакая другая тРНК соединиться с этим комплексом не может. В свою очередь связывание мРНК с малой рибосомной субъединицей осуществляется посредством образования нуклеотидных пар между последовательностью примерно из восьми нуклеотидов (последовательность Шайна-Дальгарно), которая расположена вблизи 5'-конца мРНК, и комплементарной 3'-концевой последовательностью рРНК, связанной с малой рибосомной субъединицей. К комплексу fMet-тРНКfMet-мРНК-малая субъединица присоединяется большая субъединица, и образуется инициаторный комплекс (комплекс инициации) (рис. 3.15).

Рис. 3.15. Инициация трансляции в прокариотической клетке. Последовательность Шайна—Дальгарно (Ш—Д), находящаяся вблизи 5'-конца мРНК, связывается с комплементарной 3'-концевой последовательностью рРНК, образующей комплекс с малой рибосомной субъединицей. Антикодон (UAC) инициаторной fMet-тРНКfMet спаривается со старт-кодоном (AUG) мРНК. К образовавшемуся комплексу присоединяется большая рибосомная субъединица, и образуется комплекс инициации. Аминогруппа метионина, связанного с инициаторной тРНК, формилирована (СНО) (на рисунке не изображено). После трансляции формилметионин отщепляется от белковой цепи.

У эукариот трансляция инициируется связыванием специфической «нагруженной» инициаторной тРНК (Met-TPHKMet) и факторов инициации с малой рибосомной субъединицей. Затем мРНК присоединяется своим 5'-концом к комплексу тРНК — малая рибосомная субъединица, и комплекс продвигается по мРНК до старт-кодона (AUG). Далее антикодон UAC инициаторной Met rPHKMet спаривается с кодоном AUG мРНК. К комплексу присоединяется большая рибосомная субъединица, и образуется инициаторный комплекс (рис. 3.16.)

Этапы элонгации и терминации у про- и эукариот во многом сходны. Процесс элонгации включает образование пептидных связей между соседними аминокислотами, при этом очередность присоединяемых аминокислот определяется очередностью кодонов в мРНК (рис. 3.17). Рассмотрим процесс более подробно. После образования инициаторного комплекса кодон в молекуле мРНК, следующий за кодоном AUG, спаривается с комплементарным ему антикодоном соответствующей тРНК, определяя таким образом, какая из нагруженных тРНК присоединится к рибосоме (ненагруженные тРНК не связываются с рибосомами). Если вторым триплетом в мРНК оказывается CUG, то следующей к рибосомному комплексу присоединяется несущая лейцин тРНК с антикодоном 3'-GAC-5'. Когда эта тРНК оказывается на месте, между карбоксильной группой метионина и аминогруппой лейцина с помощью ферментативной активности, присущей" большой субъединице, образуется пептидная связь, при этом лейцин остается связанным со своей тРНК, а метионин отсоединяется от инициаторной тРНК, и последняя отделяется от рибосомы. Комплекс метионин—лейцин—tPHKLeu—мРНК «протягивается» через рибосому (транслокация), так что следующий кодон мРНК может связаться с нагруженной тРНК, несущей соответствующий антикодон. Если третьим кодоном мРНК является UUU, то следующей аминокислотой в растущей полипептидной цепи будет фенилаланин; его доставит к рибосоме тРНК с антикодоном ААА. Когда эта тРНК окажется на месте, между карбоксильной группой лейцина и аминогруппой фенилаланина образуется пептидная связь. tPHKLeu отделится от рибосомы, произойдет транслокация пептидил-тРНКPhe (тРНК с присоединенной к ней растущей полипептидной цепью), и следующий кодон мРНК сможет связаться с антикодоном соответствующей нагруженной тРНК. Эти события — связывание нагруженной тРНК с мРНК благодаря комплементарному спариванию кодона с антикодоном, образование пептидной связи, отсоединение «разгруженной» тРНК, транслокация — продолжаются до тех пор, пока не соединятся друг с другом все аминокислоты, закодированные в мРНК. Трансляция происходит в направлении 5'—3' со скоростью примерно 15 аминокислот в секунду. Когда 5'-конец мРНК высвобождается из рибосомного комплекса, он может связаться с другим таким же комплексом, так что одна молекула мРНК может одновременно транслироваться множеством рибосом.

Рис. 3.16. Инициация трансляции в эукариотической клетке. Малая рибосомная субъединица связывается с инициаторной тРНК, «нагруженной» метионином (Met-TPHKMet), комплекс продвигается по мРНК, пока антикодон UAC инициаторной тРНК не спарится со старт-кодоном AUG мРНК. Далее к комплексу мРНК—тРНК—малая субъединица присоединяется большая субъединица и образуется комплекс инициации.

Рис. 3.17. Элонгация полипептидной цепи. А. Второй кодон (CUG) в мРНК связывается с антикодоном (GAC) Leu-тРНКLeu. Б. Метионин образует пептидную связь с лейцином, доставленным тРНКLeu, освободившаяся от аминокислоты инициаторная тРНК отсоединяется. В. Транслокация комплекса пептидил-тРНК—мРНК с экспонированием следующего кодона (UUU). Г. Третий кодон (UUU) спаривается с антикодоном ААА Рhe-тРНKPhe. Д Лейцин образует пептидную связь с фенилаланином, доставленным тРНКРhе, освободившаяся от аминокислоты тРНКLeu отсоединяется от рибосомы. E. Транслокация комплекса пептцидил-тРНК—мРНК с экспонированием следующего кодона, и т. д.

Элонгация продолжается до тех пор, пока рибосома не дойдет до кодона UAA, UAG или UGA (стоп-кодон, терминирующий кодон) (рис. 3.18). В норме в клетках отсутствуют тРНК с антикодонами, комплементарными сигналам терминации. Их узнают белковые факторы освобождения (терминации). При связывании фактора освобождения с рибосомой происходит гидролиз связи между последней тРНК и полипептидом, свободная тРНК, полипептидная цепь и мРНК отсоединяются от рибосомы. Рибосома диссоциирует на субъединицы, которые могут вновь участвовать в трансляции.

После трансляции многие полипептиды подвергаются различным модификациям. У большинства из них отщепляется N-концевой метионин, так что N-концевым остатком становится вторая аминокислота. У эукариот происходит так называемый процессинг некоторых белков, когда полипептвдная цепь расщепляется в определенных сайтах с образованием более коротких белковых молекул со специфическими функциями. В некоторых случаях, особенно в эукариотических клетках, к определенным аминокислотам ферментативным путем присоединяются фосфатные группы, липиды, углеводы или другие низкомолекулярные соединения. В результате этих химических модификаций образуются белки, выполняющие в клетке специфические функции. Генетический словарь состоит из 64 кодонов. Три из них — это стоп-кодоны, а один (AUG) — старт-кодон (табл. 3.2), кодирующий еще и аминокислоту метионин. Когда кодон AUG находится не на 5'-конце молекулы мРНК, а в ее внутренней области, то он распознается другой тРНК (Met-TPHKMet), к которой присоединен немодифицированный метионин. Аминокислота триптофан кодируется всего одним кодоном (UGG), остальные аминокислоты, из которых состоят белки, — по крайней мере двумя, чаще четырьмя, а иногда и шестью кодонами. Например, для лейцина существует шесть кодонов: UUA, UUG, CUU, CUC, CUA и CUG. Синонимичные кодоны используются различными организмами с разной частотой. Из четырех кодонов для глицина GGA используется в структурных генах человека в 26% случаев, а в Escherichia coli — в 9%. Такая же ситуация наблюдается и для стоп-кодонов. Так, у человека частота использования кодонов UAA, UAG и UGA составляет 0,22, 0,17 и 0,61 соответственно, а у Е. coli — 0,62, 0,09 и 0,30. Несмотря на все эти различия, генетический код у всех организмов, за редким исключением, одинаков.

Таблица 3.2. Генетический код и частота использования разных кодонов в геноме Е. coli и человека

Кодон

Аминокислота Частота использования

Кодон

Аминокислота

Частота использования



Е. coli

человек



Е. coli

человек

GGG

Глицин

0,13

0,23

UAG

Стоп

0,09

0,17

GGA

Глицин

0,09

0,26

UAA

Стоп

0,62

0,22

GGU

Глицин

0,38

0,18

UAU

Тирозин

0,53

0,42

GGC

Глицин

0,40

0,33

UAC

Тирозин

0,47

0,58

GAG

Глутаминовая кислота

0,30

0,59

UUU

Фенилаланин

0,51

0,43

GAA

Глутаминовая кислота

0,70

0,41

UUC

Фенилаланин

0,49

0,57

GAU

Аспарагиновая кислота

0,59

0,44

UCG

Серин

0,13

0,06

GAC

Аспарагиновая кислота

0,41

0,56

UCA

Серин

0,12

0,15

GUG

Валин

0,34

0,48

UCU

Серин

0,19

0,17

GUA

Валин

0,17

0,10

UCC

Серин

0,17

0,23

GUU

Валин

0,29

0,17

AGU

Серин

0,13

0,14

GUC

Валин

0,20

0,25

AGC

Серин

0,27

0,25

GCG

Аланин

0,34

0,10

CGG

Аргинин

0,08

0,19

GCA

Аланин

0,22

0,22

CGA

Аргинин

0,05

0,10

GCU

Аланин

0,19

0,28

CGU

Аргинин

0,42

0,09

GCC

Аланин

0,25

0,40

CGC

Аргинин

0,37

0,19

AAG

Лизин

0,24

0,60

AGG

Аргинин

0,03

0,22

AAA

Лизин

0,76

0,40

AGA

Аргинин

0,04

0,21

AAU

Аспарагин

0,39

0,44

CAG

Глутамин

0,69

0,73

AAC

Аспарагин

0,61

0,56

САА

Глутамин

0,31

0,27

AUG

Метионин, старт

1,00

1,00

CAU

Гистидин

0,52

0,41

AUA

Изолейцин

0,07

0,14

САС

Гистидин

0,48

0,59

AUU

Изолейцин

0,47

0,35

CUG

Лейцин

0,55

0,43

AUC

Изолейцин

0,46

0,51

CUA

Лейцин

0,03

0,07

ACG

Треонин

0,23

0,12

CUU

Лейцин

0,10

0,12

АСА

Треонин

0,12

0,27

CUC

Лейцин

0,10

0,20

ACU

Треонин

0,21

0,23

UUG

Лейцин

0,11

0,12

ACC

Треонин

0,43

0,38

UUA

Лейцин

0,11

0,06

UGG

Триптофан

1.00

1,00

CCG

Пролин

0,55

0,11

UGU

Цистеин

0,43

0,42

CCA

Пролин

0,20

0,27

UGC

Цистеин

0,57

0,58

CCU

Пролин

0,16

0,29

UGA

Стоп

0,30

0,61

1

CCC

Пролин

0,10

0,33