Молекулярная биотехнология. Принципы и применение - Глик Б., Пастернак Дж. 2002

Основы молекулярной биотехнологии
Оптимизация экспрессии генов, клонированных в прокариотических системах
Заключение

Чтобы получить какой-то белковый продукт, необходимо обеспечить правильную транскрипцию кодирующего его гена и трансляцию соответствующей мРНК. Для инициации транскрипции в нужном сайте необходим промотор, а для ее остановки — терминирующий кодон. Клонированный ген часто бывает лишен таких сигнальных последовательностей, и для его экспрессии в прокариотической клетке-хозяине нужно обеспечить и то, и другое. Кроме того, поскольку для решения большинства биотехнологических задач белок должен образовываться в больших количествах, необходимо использовать промотор, который позволял бы получить высокий уровень транскрипции (сильный промотор) и распознавался РНК-полимеразой хозяйской клетки. Постоянная транскрипция клонированного гена истощает энергетические ресурсы хозяйской клетки, поэтому нужно использовать промоторы, работу которых можно регулировать либо с помощью специфических низкомолекулярных соединений, либо изменением температуры.

Эффективность синтеза белка зависит от наличия в его мРНК специфических нуклеотидных последовательностей. Чтобы предотвратить разрушение белкового продукта или обеспечить его секрецию, клонированные гены, которые кодируют этот белок, подвергают направленным изменениям. Это может быть присоединение сайта связывания рибосомы перед сайтом инициации транскрипции (который в свою очередь тоже бывает нужно присоединить) или добавление к концу клонированного гена терминирующего кодона, который обеспечивал бы остановку трансляции. Если нужно, чтобы белок секретировался, то перед клонированным геном необходимо встроить сигнальную последовательность, рамка считывания которой согласуется с таковой гена-мишени.

Еще одна проблема — невысокая стабильность белков, кодируемых клонированными генами. Рекомбинантный белок может расщепляться протеиназами хозяйской клетки. Чтобы избежать этого, можно изменить клонированный ген таким образом, чтобы на N-конце белковой молекулы оказались одна или несколько дополнительных аминокислот. В такой форме рекомбинантный белок уже не подвергается столь быстрой деградации. Кроме того, «лишние» аминокислоты иногда помогают в последующей очистке химерного белка, например с помощью иммуноаффинной хроматографии на колонке. При этом место соединения компонент подбирается так, чтобы по нему можно было расщепить молекулу (химическим или ферментативным путем) и получить эти компоненты в чистом виде.

Большинство микроорганизмов, с помощью которых получают белковые продукты, растут только в присутствии кислорода. Последний плохо растворяется в воде, и при интенсивном росте его запасы быстро истощаются. Чтобы обойти эту трудность, использовали два пути: 1) применяли штаммы, неспособные синтезировать некоторые протеолитические ферменты; 2) включали в геном хозяйских клеток гены, кодирующие гемоглобин Vitreoscilla sp., который связывает кислород окружающей среды и повышает его концентрацию в клетке.

С увеличением числа копий клонированного гена увеличивается количество синтезируемого продукта. Однако при переходе к крупномасштабному производству конструкция «плазмида/клонированная ДНК» очень часто утрачивается. Чтобы избежать этого, разработали способы интеграции клонированного гена в хромосому организма-хозяина. В этом случае ген остается в клетке как часть хозяйской ДНК.

Введение в геном организма-хозяина и экспрессия чужеродной ДНК часто приводят к нарушению его метаболизма и нормального функционирования - так называемой метаболической перегрузке. Разработан целый ряд способов, позволяющих минимизировать этот эффект и одновременно оптимизировать выход белка-мишени и стабильность трансформированных клеток.

Системы экспрессии весьма разнообразны, и исследователям приходится каждый раз подбирать условия, наиболее подходящие для получения того или иного белка в том или ином организме-хозяине. И все же, несмотря на различия в деталях, для создания самых разных систем экспрессии используются одни и те же основные приемы.

ЛИТЕРАТУРА

Amann Е., J. Brosius. 1985. «ATG vectors» for regulated high-level expression of clones genes in Escherichia coli. Gene 40: 183—190.

Aristidou A. A., K. Y. San, G. N. Bennett. 1995. Metabolic engineering of Escherichia coli to enhance recombinant protein production through acetate reduction. Biotechnol. Prog. 11: 475—478.

Bachmair A., D. Finley, A. Varshavsky. 1986. In vivo half-life of a protein in a function of its amino- terminal residue. Science 234: 179—186.

Bagdasarian M. M., E. Amann, R. Lurz, B. Ruckert, M. Bagdasarian. 1983. Activity of the hybrid trplac (lac) promoter of Escherichia coli in Pseudomonas putida. Construction of broad- host-range, controlled-expression vectors, Gene 26: 273-282.

Baker R. T., A. Varshavsky. 1991. Inhibition of the N-end rule pathway in living cells. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 1090-1094.

Chaitan K., J. E. Curtis, J. De Modena, U. Rinas, J. E. Bailey. 1990. Expression of intracellular hemoglobin improves protein synthesis in oxygen-limited Escherichia coli. Bio/Technology 8: 849-853.

Chou C. H., G. N. Bennett, K. Y. San. 1994. Effect of modified glucose uptake using genetic engineering techniques on high-level recombinant protein production in Escherichia coli dense cultures. Biotechnol. Bioeng. 44: 952—960.

de Boer H. A., L. J. Comstock, M. Vasser. 1983. The tac promoter: a functional hybrid derived from the trp and lac promoters. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 21-25.

Donovan R. S., C. W. Robinson, B. R. Glick. 1996. Optimizing inducer and culture conditions for expression of foreign proteins under the control of the lac promoter. /. Ind. Microbiol. 16: 145—154.

Ernst J. F. 1988. Codon usage and gene expression. Trends Biotechnol. 6: 196—199.

Friesen J. D., G. An. 1983. Expression vehicles used in recombinant DNA technology. Biotechnol. Adv. 1: 205-227.

Geisow M. J. 1991. Both bane and blessing—inclusion bodies. Trends Biotechnol. 9: 368—369.

Gentz R., A. Langner, A. C. Y. Chang, S. N. Cohen, H. Bujard. 1981. Cloning and analysis of strong promoters is made possible by the downstream placement of a RNA termination signal. Proc. Nath Acad. Sei. USA 78: 4936-4940.

Glick B. R. 1995. Metabolic load and heterologous gene expression. Biotechnol. Adv. 13: 247—261.

Glick B. R., G. K. Whitney. 1987. Factors affecting the expression of foreign proteins in Escherichia coli. J. Ind. Microbiol. 1: 277—282.

Goldstein M. A., R. H. Dol. 1995. Prokaryotic promoters in biotechnology, In p. 105—128. M. R. El-Gewely (ed.), Biotechnology Annual Review, vol. 1. Elsevier Science В. V., Amsterdam, The Nertherlands.

Gwynne D. I., F. P. Buxton, S. A. Williams, S. Garven, R. W. Davies. 1987. Genetically engineered secretion of active human interferon and a bacterial endoglucanase from Aspergillus nidulans. Bio/Technology 5: 713—719.

Halfmann G., H. Brailly, A. Bemadac, F. A. Montero-Julian, C. Lazdunski, D. Baty. 1993. Targeting of interleukin-2 to the periplasm of Escherichia coli. J. Gen. Microbiol. 139: 2465-2473.

Hartley J. L., T. J. Gregori. 1981. Cloning multiple copies of a DNA gene. Geve 13: 347—353.

Hockney R. C. 1994. Recent developments in heterologous protein production in Escherichia coli. Trends Biotechnol. 12: 456—463.

Hopp T. P., K. S. Prickett, V. L. Price, R. T. Libby, C. J. March, D. P. Cerretti, D. L. Urdal, P. J. Conlon. 1988. A short polypeptide marker sequence useful for recombinant protein identification and purification. Bio/Technology 6: 1204-1210.

Hsiung H. M., A. Cantrell, J. Luirink, B. Oudega, A. J. Veros, G. W. Becker. 1989. Use of bacteriocin release protein in E. coli for excretion of human growth hormone into the culture medium. Bio/Technology 7: 267—271.

Jay G., G. Khoury, A. K. Seth, E. Jay. 1981. Construction of a general vector for efficient expression of mammalian proteins to bacteria: use of a synthetic ribosome binding site. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 5543-5548.

Jespers L. S., J. H. Messens, A. De Keyser. D. Eeckhout, I. Van den Brande, Y. G. Gansemans, M. J. Lauwereys, G. P. Vlasuk, P. E. Stanssens. 1995. Surface expression and ligand-based selection of cDNAs fused to filamentous phage gene VI. Bio/Technology 13: 378—382.

Kallio P., A. Palva, I. Palva. 1987. Enhancement of a-amylase production by integrating and amplifying the a-amylase gene of Bacillus amyloliquefaciens in the genome of Bacillus subtilis. Appl. Microbiol. Biotechnol. 27: 64—71.

Kiel J. A. K. W., A. M. ten Berge, P. Borger, G. Venema. 1995. A general method for the consecutive integration of single copies of a heterologous gene at multiple locations in the Bacillus subtilis chromosome by replacement recombination. Appl. Environ. Microbiol. 61: 4244—4250.

Kolata G. 1986. New rule proposed for protein degradation. Science 234: 151—153.

Kolowsky K. S., J. G. K. Williams, A. A. Szalay. 1984. Length of foreign DNA in chimeric plasmids determines the efficiency of its integration into the chromosome of the cyanobacterium Synechococcus R2. Gene 27: 289—299.

Kozłowski M., A. VanBrunschot, G. Nash, R. W. Davies. 1988. A novel vector allowing the expression of genes in a wide range of gram-negative bacteria. Gene 70: 199—204.

Labes M., A. Puhler, R. Simon. 1990. A new family of RSF10¹⁰-derived expression and lac-fusion broad-host-range vectors for gram-negative bacteria. Gene 89: 37—46.

Lee N., J. Cozzitorto, N. Wainwright, D. Testa.

1984. Cloning with tandem gene system for high level gene expression. Nucleic Acids Res. 12: 6797-6812.

Leemans R., E. Remaut, W. Fiers. 1987. Broadhost-range expression vector based on the p^L promoter of coliphage 1: regulated synthesis of human interleukin 2 in Erwinia and Serratia species. J. Bacteriol. 169: 1899—1904.

Little M., F. Breitling, B. Micheel, S. Dübel. 1994. Surface display of antibodies, Biotechnol. Adv. 12: 539-555.

Liu S. C., D. A. Webster, M. L. Wei, В. C. Stark.

1996. Genetic engineering to contain the Vitreoscilla hemoglobin gene enhances degradation of benzoic acid by Xanthomonas maltophilia. Biotechnol. Bioeng. 49: 101—105.

Looman A. C., J. Bodlaender, M. de Gruyter, A. Vogelaar, P. H. van Knippenberg. 1986. Secondary structure as primary determinant of the efficiency of ribosomal binding sites in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 14: 5481-5497.

Magnolo S. K., D. L. Leenutaphong, J. A. DeModena, J. E. Curtis, J. E. Bailey, J. L. Galazzo, D. E. Hughes. 1991. Actinorhodin production by Streptomyces coelicolor and growth of Streptomyces lividans are improved by the expression of a bacterial hemoglobin. Bio/Technology9: 473-476.

Meerman H. J., G. Georgiou. 1994. Construction and characterization of a set of E. coli strains deficient in all known loci affecting the proteolytic stability of secreted recombinant proteins. Bio/Technology 12: 1107—1110.

Mieschendahl M., B. Müller-Hill. 1985. F'-coded, temperature-sensitive λ cI₈₅₇ repressor gene for each construction and regulation of X promoter-dependent expression systems. J. Bacteriol. 164: 1366-1369.

Mieschendahl M., T. Petris, U. Hanggi. 1986. A novel prophage independent trp regulated X p^L expression system. Bio/Technology 4: 802-808.

Murby M., M. Uhlen, S. Stähl. 1996. Upstream strategies to minimize proteolytic degradation upon recombinant production in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 7: 129—136.

Nagai K., H. C. Thogersen. 1984. Construction of ß- globin by sequence-specific proteolysis of a hybrid protein produced in Escherichia coli. Nature 309: 810-812.

Nygren P. Ä., S. Stähl, M. Uhlen. 1994. Engineering proteins to facilitate bioprocessing. Trends Biotechnol. 12: 184—188.

O'Neil K. T., R H. Hoess. 1995. Phage display: protein engineering by directed evolution. Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 443—449.

Perez-Perez J., G. Marquez, J. L. Barbero, J. Gutierrez. 1994. Increasing the efficiency of protein export in Escherichia coli. Bio/Technology 12: 178-180.

Reniaut E., H. Tsao, W. Fiers. 1983. Improved plasmid vectors with therm oindncible expression and temperature-regulated runaway regulation. Gene 22: 103-113.

Rogers S., R. Wells, M. Rechsteiner. 1986. Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis. Science 234: 364-368.

Sander F. C., R. A. Fachini, D. E. Hughes, J. L. Galazzo, J. E. Bailey. 1994. Expression of Vitreoscilla hemoglobin in Corynebacterium glutamicum increases final concentration and yield of L-lysine, p. 607—610, ln L. Alberghina, L. Frontali, P. Sensi (ed.). Proceedings of the 6th European Congress on Biotechnology. Elsevier Science B.V., Amsterdam, The Netherlands.

Sassenfeld H. M., 1990. Engineering proteins for purification. Trends Biotechnol. 8: 88—93.

Simmons L. C., D. G. Yansura. 1996. Translational level is a critical factor for the secretion of heterologous proteins in Escherichia coli. Nat. Biotechnol. 14: 629—634.

Sung W. L., F. L. Yao, D. M. Zahab, S. A. Narang.

1986. Short synthetic oligodeoxyribonucleotide leader sequences enhance accumulation of human proinsulin synthesized in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83: 561—565.

Talmadge K., W. Gilbert. 1982. Cellular location affects protein stability in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 1830-1833.

Taylor W. M., P. J. Hagerman. 1987. A general method for cloning DNA fragments in multiple copies. Gene 53: 139—144.

Tobias J. W., T. E. Schrader, G. Rocap, A. Varshavsky. 1991. The N-end rule in bacteria. Science 254: 1374-1377.

Tsuchiya M., Y. Morinaga. 1988. Genetic control systems of Escherichia coli can confer inducible expression of cloned genes in coryneform bacteria. Bio/Technology 6: 428—430.

Weinstock G. M., C. A. Rhys, M. L. Berman, B. Hampar, D. Jackson, T. J. Silhavy, J. Weisemann, M. Zweig. 1983. Open reading frame expression vectors: a general method for antigen production in Escherichia coli using protein fusion to ß-galactosidase, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 4432-4436.

Wilcox G., G. M. Studnicka. 1988. Expression of foreign proteins in microorganisms. Biotechnol. Appl. Blochem. 10: 500—509.

Wilkinson D. L., R. G. Harrison, 1991. Predicting the solubility of recombinant proteins in Escherichia coli. Bio/Technology 9: 443—448.

Williams J. G. K., A. A. Szalay. 1983. Stable integration of foreign DNA into the chromosome of the cyanobacterium Synechococcus R2. Gene 24: 37-51.

Wong R. S. Y., R. A. Wirtz, R. E. W. Hancock. 1995. Pseudomonas aeruginosa outer membrane protein OprF as an expression vector for foreign epitopes: the effects of positioning and length on the antigenicity of the epitope. Gene 158: 55—60.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Какими способами можно влиять на экспрессию генов, клонированных в прокариотических организмах?

2. Что такое ген lacI^q и как его используют?

3. Почему плазмидный вектор с максимально сильным промотором не всегда является наилучшим экспрессирующим вектором?

4. Что такое taс-промотор и как осуществляется его регуляция?

5. Промотор p^L фага λ, способного инфицировать только Е. coli, тем не менее иногда используют как составную часть экспрессирующего вектора с широким кругом хозяев. Как «приспособить» p^L - промотор для инициации транскрипции в других организмах?

6. Иногда стратегия синтеза белка-мишени включает получение этого белка в составе химерного продукта. В чем преимущество такого подхода? Как создают химерный белок?

7. Что такое тельца включения и как избежать их образования?

8. В чем преимущество локализации чужеродных белков на поверхности клеток? Какие стратегии используются для того, чтобы сделать белки секретируемыми?

9. Как встроить в одну плазмиду несколько копий гена?

10. Как решить проблему обеспечения кислородом клеток Е. coli, синтезирующих в большом количестве чужеродный белок?

11. Последовательность-мишень может быть встроена в хромосомную ДНК двумя способами: 1) сама по себе; 2) в составе плазмиды, которая несет эту последовательность. Как происходит каждое из этих событий? Какие

преимущества или недостатки имеет интеграция плазмидного вектора в хозяйскую ДНК?

12. Что такое метаболические перегрузки и какова их причина?

13. Предложите несколько способов снижения метаболической перегрузки Е. coli, синтезирующих в большом количестве рекомбинантный белок.