Молекулярная биотехнология. Принципы и применение - Глик Б., Пастернак Дж. 2002
Молекулярная биотехнология микробиологических систем
Молекулярная диагностика
Успехи современной медицины и сельского хозяйства часто зависят от того, удается ли обнаруживать специфические вирусы, бактерии, грибы, паразитические микроорганизмы, белки и низкомолекулярные соединения в организме человека или животных, в растениях, воде или почве. Например, профилактику и лечение любого инфекционного заболевания значительно облегчает ранняя и точная идентификация вызвавшего его патогенного микроорганизма. Для проведения многих диагностических процедур необходимо сначала вырастить культуру потенциально патогенного микроорганизма и лишь затем проанализировать спектр его физиологических свойств. Хотя подобные тесты весьма эффективны и обладают достаточно высокой специфичностью, они часто занимают много времени и являются дорогостоящими. Это относится к идентификации и бактерий, и паразитических микроорганизмов (табл. 9.1). Кроме того, весьма ограничена возможность выявления тех патогенных микроорганизмов, которые плохо растут в культуре либо вообще не поддаются культивированию. В качестве примера можно привести облигатных внутриклеточных паразитов Chlamydia trachomatis, которые вызывают хламидиоз, болезнь, передающуюся половым путем и распространенную в Северной Америке и Европе. Хламидиоз трудно диагностировать, поскольку для этого необходима перевиваемая культура клеток. При этом часто получают ложноотрицательные результаты (т. е. ошибочно диагностируют отсутствие микроорганизма), в результате чего не проводится адекватное лечение. Безусловно, если для выявления микроорганизма необходимо выращивать его в культуре, то рутинной может стать идентификация лишь нескольких из всех известных патогенных микроорганизмов. Чтобы устранить это принципиальное ограничение, были разработаны методы молекулярной диагностики, в основе которых лежат иммунологические подходы или методы обнаружения специфической ДНК.
Таблица 9.1. Сравнение некоторых методов диагностики инфекционных заболеваний, вызванных паразитическими микроорганизмами1)
|
Метод |
Преимущества |
Недостатки |
|
Микроскопическое исследование |
Простота Прямое выявление паразитических микроорганизмов Возможность разграничения микроорганизмов по морфологическим признакам |
Трудоемкость, длительность Низкая чувствительность Невозможность разграничения сходных микроорганизмов Необходимость высокой квалификации для интерпретации результатов |
|
Культивирование in vitro и иммунизация мышей |
Обнаружение только жизнеспособных паразитических микроорганизмов Возможность определения вирулентности и инфекционности |
Длительность анализа, высокая стоимость Разные породы животных дают разные ответы Потеря жизнеспособности в организме животного Использование животных |
|
Определение антител в сыворотке |
Простота, непродолжительность анализа Возможность автоматизации Возможность тестирования большого числа образцов |
Не всегда специфичен Невозможность разграничения острой и латентной форм инфекции |
|
Гибридизация и ПЦР |
Быстрота, высокие чувствительность и специфичность Прямое обнаружение паразитических микроорганизмов Возможность разграничения разных видов Независимость результатов от предыдущих инфекций Не требуют жизнеспособности паразитов Возможность автоматизации |
Высокая стоимость анализов, многоэтапность Невозможность различить живые и мертвые микроорганизмы Возможность получения ложноположитeльных и ложноотрицательных результатов |
1) Поданным работы Weiss, Clin. Microbiol. Rev. 8: 113—130, 1995.
Любой метод выявления патогенных микроорганизмов должен быть достаточно простым и обладать высокой специфичностью и чувствительностью. Специфичный диагностический тест должен давать положительный ответ только на микроорганизм или молекулу-мишень, чувствительный — обнаруживать очень малые количества такой мишени даже на фоне других микроорганизмов или молекул, загрязняющих образец. Простота метода подразумевает, что он является достаточно продуктивным, эффективным и недорогим для рутинного применения.
По оценкам специалистов, объем мирового рынка иммунодиагностических тестов в 1993 г. составил 3,4 млрд. долл. США и в ближайшие 10—15 лет будет возрастать на 5—10% ежегодно. В 1994 г. объем мирового рынка ДНК-диагностических тестов был равен примерно 80 млн. долл., к 2000 г. он, по-видимому, составит 600 млн. долл., а к 2004 г. — 2 млрд. долл. В этой главе мы обсудим принципы некоторых методов молекулярной диагностики и сферу их применения.