Молекулярная биотехнология. Принципы и применение - Глик Б., Пастернак Дж. 2002

Молекулярная биотехнология микробиологических систем
Молекулярная диагностика

Успехи современной медицины и сельского хозяйства часто зависят от того, удается ли обнаруживать специфические вирусы, бактерии, грибы, паразитические микроорганизмы, белки и низкомолекулярные соединения в организме человека или животных, в растениях, воде или почве. Например, профилактику и лечение любого инфекционного заболевания значительно облегчает ранняя и точная идентификация вызвавшего его патогенного микроорганизма. Для проведения многих диагностических процедур необходимо сначала вырастить культуру потенциально патогенного микроорганизма и лишь затем проанализировать спектр его физиологических свойств. Хотя подобные тесты весьма эффективны и обладают достаточно высокой специфичностью, они часто занимают много времени и являются дорогостоящими. Это относится к идентификации и бактерий, и паразитических микроорганизмов (табл. 9.1). Кроме того, весьма ограничена возможность выявления тех патогенных микроорганизмов, которые плохо растут в культуре либо вообще не поддаются культивированию. В качестве примера можно привести облигатных внутриклеточных паразитов Chlamydia trachomatis, которые вызывают хламидиоз, болезнь, передающуюся половым путем и распространенную в Северной Америке и Европе. Хламидиоз трудно диагностировать, поскольку для этого необходима перевиваемая культура клеток. При этом часто получают ложноотрицательные результаты (т. е. ошибочно диагностируют отсутствие микроорганизма), в результате чего не проводится адекватное лечение. Безусловно, если для выявления микроорганизма необходимо выращивать его в культуре, то рутинной может стать идентификация лишь нескольких из всех известных патогенных микроорганизмов. Чтобы устранить это принципиальное ограничение, были разработаны методы молекулярной диагностики, в основе которых лежат иммунологические подходы или методы обнаружения специфической ДНК.

Таблица 9.1. Сравнение некоторых методов диагностики инфекционных заболеваний, вызванных паразитическими микроорганизмами1)

Метод

Преимущества

Недостатки

Микроскопическое исследование

Простота

Прямое выявление паразитических микроорганизмов Возможность разграничения микроорганизмов по морфологическим признакам

Трудоемкость, длительность

Низкая чувствительность

Невозможность разграничения сходных микроорганизмов

Необходимость высокой квалификации для интерпретации результатов

Культивирование in vitro и иммунизация мышей

Обнаружение только жизнеспособных паразитических микроорганизмов

Возможность определения вирулентности и инфекционности

Длительность анализа, высокая стоимость

Разные породы животных дают разные ответы

Потеря жизнеспособности в организме животного

Использование животных

Определение антител в сыворотке

Простота, непродолжительность анализа

Возможность автоматизации

Возможность тестирования большого числа образцов

Не всегда специфичен

Невозможность разграничения острой и латентной форм инфекции

Гибридизация и ПЦР

Быстрота, высокие чувствительность и специфичность

Прямое обнаружение паразитических микроорганизмов

Возможность разграничения разных видов

Независимость результатов от предыдущих инфекций

Не требуют жизнеспособности паразитов

Возможность автоматизации

Высокая стоимость анализов, многоэтапность

Невозможность различить живые и мертвые микроорганизмы

Возможность получения ложноположитeльных и ложноотрицательных результатов

1) Поданным работы Weiss, Clin. Microbiol. Rev. 8: 113—130, 1995.

Любой метод выявления патогенных микроорганизмов должен быть достаточно простым и обладать высокой специфичностью и чувствительностью. Специфичный диагностический тест должен давать положительный ответ только на микроорганизм или молекулу-мишень, чувствительный — обнаруживать очень малые количества такой мишени даже на фоне других микроорганизмов или молекул, загрязняющих образец. Простота метода подразумевает, что он является достаточно продуктивным, эффективным и недорогим для рутинного применения.

По оценкам специалистов, объем мирового рынка иммунодиагностических тестов в 1993 г. составил 3,4 млрд. долл. США и в ближайшие 10—15 лет будет возрастать на 5—10% ежегодно. В 1994 г. объем мирового рынка ДНК-диагностических тестов был равен примерно 80 млн. долл., к 2000 г. он, по-видимому, составит 600 млн. долл., а к 2004 г. — 2 млрд. долл. В этой главе мы обсудим принципы некоторых методов молекулярной диагностики и сферу их применения.