Молекулярная биотехнология. Принципы и применение - Глик Б., Пастернак Дж. 2002

Основы молекулярной биотехнологии
Направленный мутагенез и генная инженерия белков
Заключение

Свойства любого белка зависят от его конформации, которая в свою очередь определяется аминокислотной последовательностью. Некоторые аминокислоты в полипептидной цепи играют ключевую роль в определении специфичности, термостабильности и других свойств белка, так что замена единственного нуклеотида в гене, кодирующем белок, может привести к включению в него аминокислоты, приводящему к понижению его активности, либо, напротив, к улучшению каких-то его специфических свойств. С развитием технологии рекомбинантных ДНК появилась возможность производить специфические замены в клонированных генах и получать белки, содержащие нужные аминокислоты в заданных сайтах. Такой подход получил название направленного мутагенеза. Как правило, интересующий исследователя ген клонируют в ДНК фага М13. Одноцепочечную форму ДНК этого фага копируют с использованием олигонуклеотидного праймера, синтезированного таким образом, чтобы в ген-мишень был встроен определенный нуклеотид. Затем трансформируют двухцепочечными ДНК М13 клетки Е. coli. Часть образующихся в клетках фаговых частиц несет ген, содержащий нужную мутацию. Такие частицы идентифицируют, встраивают мутантный ген в экспрессирующий вектор, синтезируют белок и определяют его активность. Вносить изменения в клонированные гены можно также с помощью плазмид или ПЦР. Обычно заранее не известно, какую именно аминокислоту (аминокислоты) необходимо заменить для того, чтобы улучшить то или иное свойство белка-мишени. Поэтому предпочтительно использовать случайный, а не олигонуклеотид-направленный мутагенез.

Выбор аминокислоты, подлежащей замене, как правило, производится с учетом ее роли в функционировании белка. Данные об этом получают в ходе генетических исследований или методом рентгеноструктурного анализа трехмерной структуры белка. Изменяя специфические сайты или целые участки белковой молекулы, можно повысить термостабильность белка, изменить его чувствительность к pH, специфичность, аллостерическую регуляцию, потребность в кофакторе и другие свойства. Так, термостабильность триозофосфатиозомеразы удалось повысить, заменив аминокислоты в двух позициях. Этот подход можно использовать как для придания новых свойств уже существующим белкам, так и для создания уникальных ферментов.

ЛИТЕРАТУРА

Ahern Т. J., J. I. Casal, G. A. Petsko, А. М. Klibanov. 1987. Control of oligometric enzyme-thermostability by protein engineering. Proc. Natl. Acad. Sсi. USA 84: 675-679.

Brange J., U. Ribel, J. F. Hansen, G. Dodson, M. T. Hansen, S. Havelund, S. G. Melberg, F. Norris, K. Norris, L. Snel, A. R. Sorensen, H. O. Voigt. 1988. Monomeric insulins obtained by protein engineering and their medical implications. Nature 333: 679—682.

Chen K., F. H. Arnold. 1991. Enzyme engineering for nonaqueous solvents: random mutagenesis to enhance activity of subtilisin E in polar organic media. Bio/Technology 9: 1073—1077.

Deng W. P., J. A. Nickoloff. 1992. Site-directed mutagenesis of virtually any plasmid by eliminating a unique site. Anal. Biochem. 200: 81—88.

Geisselsoder J., F. Witney, P. Yuckenberg. 1987. Efficient site-directed in vitro mutagenesis. Bio Techniques 5: 786—791.

Herlitze S., M. Koenen. 1990. A general and rapid mutagenesis method using polymerase chain reaction. Gene 91: 143—147.

Hermes J. D., S. M. Parekh, S. C. Blacklow, H. Köster, J. R. Knowles. 1989. A reliable method for random mutagenesis: the generation of mutant libraries using spiked oligodeoxyribonucleotide primers. Gene 84: 143—151.

Keyt B. A., N. F. Paoni, C. J. Refino, L. Berleau, H. Nguyen, A. Chow, J. Lai, L. Pena, C. Pater, J. Ogez, T. Etcheverry, D. Botstein, W. F. Bennett. 1994. A faster-acting and more potent form of tissue plasminogen activator. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 3670-3674.

Kim Y.-G., J. Cha, S. Chandrasegaran. 1996. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Foki cleavage domain. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 1156-1160.

Kirchhoff F., R. C. Desrosiers. 1995. Random mutagenesis of short target DNA sequences via PCR with degenerate oligonucleotides. Methods Mol. Biol. 57: 323-333.

Landt O., H.-P. Grunert, U. Hahn. 1990. A general method for rapid site-directed mutagenesis using the polymerase chain reaction. Gene 96: 125—128.

Mark D. F., S. D. Lu, A. A. Creasey, R. Yamamoto, L. S. Lin. 1984. Site-specific mutagenesis of the human fibroblast interferon gene. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 5662—5666.

Matsumura M., G. Signor, B. W. Mathews. 1989. Substantial increase of protein stability by multiple disulfide bonds. Nature 342: 291—293.

Nosoh Y., T. Sekiguchi. 1990. Protein engineering for thermostability. Trends Biotechnol. 8: 16—20.

Piechocki M. P., R. N. Hines. 1994. Oligonucleotide design and optimized protocol for site-directed mutagenesis. Bio Techniques 16: 702—707.

Shiraishi H., Y. Shimura. 1988. A rapid and efficient method for targeted random mutagenesis. Gerte 64: 313-319.

Smith M. 1985. In vitro mutagenesis. Annu. Rev. Genet. 19: 423-462.

Strausberg S. L., P. A. Alexander, D. T. Gallagher, G. L. Gilliland, B. L. Barnett, P. N. Bryan. 1995. Directed evolution of a subtilisin with calcium-independent stability. Bio/Technology 13: 669-673.

Wakarchuk W. W., W. L. Sung, R. L. Campbell, A. Cunningham, D. C. Watson, M. Yaguchi. 1994. Thermostabilization of the Bacillus circulars xylanase by the introduction of disulfide bonds. Protein Eng. 7: 1379—1386.

Wetzel R., L. J. Perry, C. Veilleux. 1991. Mutations in human interferon gamma affecting inclusion body formation identified by a general immunochemical screen. Bio/Technology 9: 731—737.

Wilkinson A. J., A. R. Fersht, D. M. Blow, P. Carter, G. Winter. 1984. A large increase in enzyme-substrate affinity by protein engineering. Nature 307: 187-188.

Zoller M. J., M. Smith. 1982. Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any fragment of DNA. Nucleic Acids Res. 10: 6487—6500.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Какие физические и химические свойства ферментов можно изменить с помощью направленного мутагенеза?

2. Предположим, что вы клонировали бактериальный ген, экспрессирующийся в Е. coli, и хотите изменить его активность. Однако в результате применения стандартного метода мутагенеза с использованием ДНК М13 по ряду технических причин лишь небольшая часть клонов приобрела мутантный ген-мишень, а большинство из них содержит интактный ген. Как увеличить долю клонов, содержащих ДНК с нужной мутацией?

3. Предположим, что вы выделили ген фермента, синтезирующегося в Е. coli. Опишите стратегию изменения каталитической активности этого фермента, принимая во внимание тот факт, что вы знаете нуклеотидную последовательность кодирующего его гена, но не знаете, какой из участков молекулы фермента ответствен за каталитическую активность.

4. Каковы преимущества и недостатки олигонуклеотид-направленного мутагенеза с использованием бактериофага М13 и ПЦР?

5. Опишите стратегию олигонуклеотид-направленного мутагенеза с использованием плазмидной ДНК.

6. Как, используя «вырожденные» праймеры, можно вносить случайные мутации в Д НК?

7. Опишите стратегию повышения стабильности белка, в котором а) отсутствуют остатки цистеина; б) присутствует нечетное число остатков цистеина.

8. Как влияет замена аспарагина на другой аминокислотный остаток на стабильность белка?

9. Каким образом можно изменить потребность фермента в кофакторах?

10. Как вы будете изменять каталитическую активность или субстратную специфичность фермента, ген которого вы выделили? В чем смысл этой процедуры?