Молекулярная биотехнология. Принципы и применение - Глик Б., Пастернак Дж. 2002
Молекулярная биотехнология микробиологических систем
Биодеградация токсичных соединений и утилизация биомассы
Заключение
Биодеградация — это процесс разрушения микроорганизмами веществ, загрязняющих окружающую среду. Многие бактерии рода Pseudomonas несут плазмиды, кодирующие ферменты, которые катализируют расщепление ароматических и галогенсодержащих огранических соединений. В большинстве случаев одна плазмида содержит гены ферментов одного специфичного катаболического пути. Объединяя плазмиды разных штаммов Pseudomonas в одном хозяине, можно создать организм, способный к деградации нескольких соединений. Кроме того, с помощью генетических манипуляций можно расширить спектр субстратов, разрушаемых с помощью определенного ферментативного пути.
Под биомассой здесь понимается вся совокупность веществ и материалов, побочных продуктов пищевой и перерабатывающей промышленности, которая может служить сырьем для получения ценных продуктов. Производство этанола или фруктозы из молотого зерна происходит в несколько ферментативных стадий. Участвующие в этих процессах ферменты часто используются однократно. Чтобы повысить эффективность ферментативных реакций и снизить стоимость процессов, исследователи занимаются клонированием и исследованием свойств бактериальных генов, кодирующих термостабильные, обладающие высокой каталитической активностью и устойчивые к действию спирта ферменты.
Для повышения эффективности промышленного производства этанола в бактерию Zymomonas mobilis были введены гены, благодаря экспрессии которых она могла использовать в качестве источника углерода широкий спектр соединений. Предприняты первые шаги на пути создания штаммов Lactobacillus plantarum, способных эффективно расщеплять крахмал, содержащийся в большом количестве в такой важной сельскохозяйственной культуре, как люцерна.
При переработке растительного материала часто образуется большое количество лигноцеллюлозных отходов, которые раньше не находили применения. Сейчас лигноцеллюлоза служит сырьем для получения углеродсодержащих соединений, в первую очередь глюкозы, которые можно использовать в других процессах. Лигноцеллюлоза — это комплекс из лигнина, гемицеллюлозы и целлюлозы, не подверженный действию ферментов без предварительной обработки. Проводимые в последнее время исследования были направлены в основном на изучение механизма расщепления целлюлозы с образованием глюкозы. Клонированы и охарактеризованы гены эндоглюканаз, экзоглюканаз и ß-глюкозидаз многих микроорганизмов, но пока не определен набор ферментов, осуществляющих масштабное эффективное расщепление целлюлозы in vitro.
Некоторые виды биомассы (например, сыворотка, целлюлозные отходы) и продукты переработки нефти могут служить субстратом при культивировании микроорганизмов. Предполагалось, что эти чистые культуры, а также их продукты (так называемый белок одноклеточных организмов, БОО) можно будет использовать в качестве пищевых добавок или корма для скота. К сожалению, вследствие дороговизны получаемых продуктов, их невысоких вкусовых качеств, а иногда и токсичности производство БОО оказалось экономически нецелесообразным. Однако есть надежда, что с помощью генетических манипуляций все-таки удастся создать систему, позволяющую получать дешевые биологические добавки на основе БОО.
ЛИТЕРАТУРА
Barnett С. С. 1991. Cloning and amplification of the gene encoding an extracellular ß-glucosidase from Trichoderma reesei: evidence for improvedrates of saccharification of cellulosic substrates. Bio/Technology 9: 562—567.
Beauregard M., C. Dupont, R. M. Teather, M. A. Hefford. 1995. Design, expression, and initial characterization of MB1, a de novo protein enriched in essential amino acids. Bio/Technology 13: 974—981.
Beguin P. 1990. Molecular biology of cellulose degradation. Annu. Rev. Microbiol. 44: 219—248.
Brown D. E. 1983. Lignocellulose hydrolysis. Philos. Trans. R. Soc. Loud. В 300: 305—322.
Buchholz S. E., M. M. Dooley, D. E. Eveleigh. 1987. Zymomonas—an alcoholic enigma. Trends Biotechnol. 5: 199—204.
Buchholz S. E., D. E. Eveleigh. 1990. Genetic modification of Zymomonas mobilis. Biotechnol. Adv. 8:547-581.
Chakrabarty A. M. March 1981. Microorganisms having multiple compatible degradative energygenerating plasmids and preparation thereof. U.S. patent 4,259.444.
Cole G. E., P. C. McCabe, D. Inlow, D. H. Gelfand, A. Ben-Bassat, M. A. Innis. 1988. Stable expression of Aspergillus awamori glucoamylase in distiller’s yeast. Bio/Technology 6: 417—421.
Cork D. J., J. P. Krueger. 1991. Microbial transformation of herbicides and pesticides. Adv. Appl. Microbiol. 36: 1—66.
Dekker K., A. Sugiura, H. Yamagata, K. Sakaguchi, S. Udaka. 1992. Efficient production of thermostable Thermus thermophilus xylose isomerase in Escherichia coli and Bacillus brevis. Appl. Microbiol. Biotechnol. 36: 727—732.
Eveleigh D. E. 1987. Cellulase: a perspective. Philos. Trans. R. Soc. Lond. В 321: 435—447.
Fitzsimons A., P. Hols, J. Jore, R. J. Leer, M. O'Connell, J. Delcour. 1994. Development of an amylolytic Lactobacillus plantarum silage strain expressing the Lactobacillus amylovorus a- amylase gene. Appl. Environ. Microbiol. 60: 3529-3535.
Ghosal D., I.-S. You, D. K. Chatteijee, A. M. Chakrabarty. 1985. Microbial degradation of halogenated compounds. Science 228:135—142.
Glick B. R., J. J. Pasternak. 1989. Isolation, characterization and manipulation of cellulase genes. Biotechnol. Adv. 7: 361—386.
Innis M. A., M. J. Holland, P. C. McCabe, G. E. Cole, V. P. Wittman, R. Tal, K. W. K. Watt, D. Н. Gelfand, J. P. Holland, J. H. Meade. 1985. Expression, glycosylation and secretion of an Aspergillus glucoamylase by Saccharomyces cerevisiae. Science 228: 21—26.
Kallio P., A. Palva, I. Palva. 1987. Enhancement of a-amylase production by integrating and amplifying the a-amylase gene of Bacillus amyloliquefaciens in the genome of Bacillus subtilis. Appl. Microbiol. Biotechnol. 27: 64-71.
Kennedy J. F., V. M. Cabalda, C. A. White. 1988. Enzymic starch utilization and genetic engineering. Trends Biotechnol. 6: 184—189.
Knowles J., P. Lehtovaara, T. Teeri. 1987. Cellulase families and their genes. Trends Biotechnol. 5: 255-261.
Kolenc R. J., W. E. lnniss, B. R. GHck, C. W. Robinson, С. I. Mayfield. 1988. Transfer and expression of mesophilic plasmid-mediated degradative capacity in a psychrotrophic bacterium. Appl. Environ. Microbiol. 54: 638—641.
Kumar V., S. Ramakrishnan, T. T. Teeri, J. К. C. Knowles, B. S. Hartley. 1992. Saccharomyces cerevisiae cells secreting an Aspergillus niger ß-galactosidase grow on whey permeate. Bio/Technology 10: 82-85.
Lamed R., J. Naimark, E. Morgenstern, E. A. Bayer. 1987. Specialized cell surface structures in cellulolytic bacteria. J. Bacteriol. 169: 3792—3800. Lynd L. R., J. H. Cushman, R. J. Nichols, C. E. Wyman. 1991. Fuel ethanol from cellulosic biomass. Science 251: 1318—1323.
Meng M., C. Lee, M. Bagdasarian, J. G. Zeikus. 1991. Switching substrate preference of thermophilic xylose isomerase from D-xylose to D-glucose by redesigning the substrate binding pocket. Proc. Natl. Acad. Sсi. USA 88: 4015-4019.
Perez-Gonzales J. A., R. Gonzales, A. Querol, J. Sendra, D. Ramon. 1993. Construction of a recombinant wine yeast strain expressing ß-(1,4)-endoglucanase and its use in microvinification processes. Appl. Environ. Microbiol. 59: 2801-2806.
Quax W. J., N. T. Mrabet, R. G. M. Luiten, P. W. Schuurhuizen, P. Stanssens, I. Lasters. 1991. Enhancing the thermostabiligy of glucose isomerase by protein engineering. Bio/Technology 9: 738-742.
Ramos J. L., A. Wasserfallen, К. Rose, К. N. Timmіs. 1987. Redesigning metabolic routes: manipulation of TOL plasmid pathway for catabolism of alkyl-benzoates. Science 235: 593-596.
Suyama A., R. Iwakiri, N. Kimura, A. Nishi, K. Nakamura, K. Furukawa. 1996. Engineering hybrid pseudomonads capable of utilizing a wide range of aromatic hydrocarbons and of efficient degradation of trichloroethylene. J. Bacteriol. 178: 4039-4046.
Timmis K. N., R. J. Steffan, R. Unterman. 1994. Designing microorganisms for the treatment of toxic wastes. Annu. Rev. Microbiol. 48: 525-557.
Verdoes J. C., A. D. van Diepeningen, P. J. Punt, A. J. M. Debets, A. H. Stouthamer, C. A. M. J. J. van den Hondel. 1994. Evaluation of molecular and genetic approaches to generate glucoamylase overproducing strains of Aspergillus niger. J. Biotechnol. 36: 165—175.
Wayman M., S. Chen, K. Doan. 1992. Bioconversion of waste paper to ethanol. Process Biochem. 27: 239-245.
Windass J. D., M. J. Worsey, E. M. Pioli, D. Pioli, P. T. Barth, К. T. Atherton, E. C. Dart, D. Byrom, K. Powell, P. J. Senior. 1980. Improved conversion of methanol to single-cell protein by Methylophilus methylotrophus. Nature 287: 396—401.
Winter R. B., K.-M. Yen, B. D. Ensley. 1989. Efficient degradation of trichloroethylene by a recombinant Escherichia coli. Bio/Technology 7: 282-285.
Witholt B., M.-J. de Smet, J. Kingma, J. B. van Beilen, M. Kok, R. G. Lageveen, G. Eggink. 1990. Bioconversions of aliphatic compounds by Pseudomonas oleovorans in multiphase bioreactors: background and economic potential. Trends Biotechnol. 8: 46—52.
Wong W. K. R., C. Curry, R. S. Parekh, S. R. Parekh, M. Wayman, R. W. Davies, D. G. Kilburn, N. Skipper. 1988. Wood hydrolysis by Cellulomonas fumi endoglucanase and exoglucanase coexpressed as secreted enzymes in Saccharomyces cerevisiae. Bio/Technology 6: 713—719.
Zhang M., C. Eddy, K. Deanda, M. Finkelstein, S. Picataggio. 1995. Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis. Science 267: 240—243.
Zylstra G. J., L. Р. Wackett, D. Т. Gibson. 1989. Trichloroethylene degradation by Escherichia coli containing the cloned Pseydomonasputida FI toluene dioxygenase genes. Appl. Environ. Microbiol. 55: 3162—3166.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. Как следует модифицировать Р. putida, чтобы получился штамм, эффективно разрушающий трихлорэтилен?
2. Опишите процедуру клонирования целлюлазных генов грибов.
3. Как используются а-амилаза и глюкоамилаза в промышленном производстве этанола? Какие манипуляции с кодирующими эти ферменты генами следует провести, чтобы повысить эффективность процесса?
4. Что представляет собой фермент глюкозоизомераза? В чем состоит ее ценность? Как и зачем можно модифицировать кодирующий ее ген?
5. Опишите достоинства и недостатки использования Zymomonas mobilis вместо Saccharomyces cerevisiae при производстве этанола. Как повысить эффективность промышленного использования Z. mobilis?
6. Как с помощью генноинженерных методов модифицировать Z. mobilis, чтобы можно было использовать этот микроорганизм для производства этанола из ксилозы?
7. Взяв три штамма Pseudomonas, один из которых использует фенол в качестве единственного источника углерода при 0 °С, второй расщепляет антрацен с образованием катехола при 35 °С, а третий расщепляет n-толуол с образованием протокатехоата при 35 °С, предложите стратегию создания штамма, который сможет использовать в качестве единственного источника углерода фенол, антрацен или n-толуол при 0 °С.
8. Как модифицировать штамм Pseudomonas, несущий плазмиду pWWO и не способный расщеплять 4-этилбензоат, чтобы он мог утилизировать это соединение?
9. Предложите стратегии выделения прокариотических эндоглюканазных и ß-глюкозидазных генов.
10. Что такое «супербацилла»?
11. Как повысить эффективность образования силоса, проводя манипуляции с Lactobacillus plantarum?
12. Как следует модифицировать бактерии рубца, чтобы они обеспечивали крупный рогатый скот незаменимыми аминокислотами?