Молекулярная биотехнология. Принципы и применение - Глик Б., Пастернак Дж. 2002

Молекулярная биотехнология микробиологических систем
Бактерии, стимулирующие рост растений
Фикcация азота

Скорость роста и урожайность растений в естественных условиях зависят от их генотипа, доступности питательных веществ, наличия в почве полезных микроорганизмов и отсутствия патогенных (так называемых фитопатогенов, от phyto — растение). Одни виды полезных природных почвенных бактерий и грибов оказывают прямое действие, другие опосредованное. Первые поставляют растениям соединения, стимулирующие их рост, вторые подавляют размножение патогенных почвенных микроорганизмов, предотвращая их негативное влияние на растение.

К основным механизмам стимуляции роста растений микроорганизмами «прямого действия» относятся: 1) фиксация атмосферного азота, который затем используется растением; 2) образование легкоусваиваемых форм железа и фосфора и/или поглощение из почвы и доставка этих полезных минеральных веществ в растения; 3) синтез фитогормонов, вызывающих пролиферацию растительных клеток. Опосредованная стимуляция роста растения каким-либо штаммом полезного микроорганизма проявляется через предотвращение роста фитопатогенного почвенного микроорганизма, который мог бы отрицательно влиять на нормальный рост и развитие растения. Такое действие называется антибиозом и может заключаться либо в истощении полезным микроорганизмом лимитирующего субстрата, либо в синтезе и секреции соединения, препятствующего росту фитопатогена.

Последние генетические эксперименты по созданию штаммов микроорганизмов, способных более эффективно стимулировать рост растений, были направлены в основном на решение следующих четырех проблем.

✵ Молекулярные механизмы фиксации азота. Цель всех исследований состояла в том, чтобы оценить возможности повышения уровня фиксации азота микроорганизмами и, следовательно, снизить количество вносимых в почву химических удобрений.

✵ Образование корневых клубеньков симбиотическими бактериями. Целью этих исследований было создание рекомбинантных бактерий, способных конкурировать с природными симбиотическими бактериями.

✵ Микробиологический синтез веществ, хелатирующих железо (сидерофоров). Есть надежда, что удастся получить штаммы микроорганизмов, подавляющие рост фитопатогенов.

✵ Микробиологический синтез фитогормонов. Эти исследования проводились для того, чтобы создать штаммы бактерий, синтезирующие и секретирующие определенные количества фитогормонов, которые ускоряли бы рост растений.

Исследования в этой области проводятся главным образом на бактериях, а не на грибах. Отчасти это обусловлено тем, что полезные грибы не удается вырастить в культуре, поэтому с ними трудно работать в лабораторных условиях, а кроме того, невозможно получить эти организмы в количестве, достаточном для инокуляции.

Азот (N₂) — газ, на долю которого приходится примерно 80% (по объему) воздуха, которым мы дышим. Растения или животные не могут использовать его непосредственно для синтеза необходимых им биологических азотсодержащих соединений типа аминокислот и нуклеотидов; предварительно азот должен быть включен в состав аммиака (фиксирован). Это требует больших энергетических затрат, поскольку тройная связь в молекуле N₂ (N = N), которую необходимо предварительно разорвать, чрезвычайно прочная. Энергия для биологической фиксации азота высвобождается при гидролизе больших количеств аденозинтрифосфата (АТР). Для химического (промышленного) превращения N₂ в аммиак используют высокие температуру и давление.

Для удовлетворения потребностей пищевой промышленности в сельскохозяйственной продукции ежегодно требуется более 100 млн. т связанного азота. Примерно половину этого количества составляют синтетические (химически синтезированные) удобрения, а большую часть второй половины растения получают от азотфиксирующих (диазотрофных) бактерий типа Rhizobium, Frankia, Azospirillum, Azotobacter и цианобактерий. Ни один из эукариотических организмов не способен связывать азот.

Благодаря применению химических удобрений удалось значительно повысить урожайность сельскохозяйственных культур, однако их продолжительное использование приводит к загрязнению почвы и истощению запасов в ней питательных веществ. К тому же химические удобрения становятся все более дорогими. Все это стимулировало поиск альтернативных источников связанного азота, в частности создание штаммов диазотрофных микроорганизмов, которые могли бы служить «бактериальными удобрениями».

Способностью к фиксации азота обладают самые разные бактерии, и многие из них в принципе могут использоваться как удобрения. Однако до тех пор, пока не будет показано, что бактериальные удобрения столь же эффективны, как и химические, вряд ли удастся преодолеть консерватизм производителей сельскохозяйственной продукции и изменить используемые в настоящее время подходы. Например, вторая по экономической значимости и по занимаемым площадям сельскохозяйственная культура в США — соя — формирует симбиотические отношения с бактерией Bradyrhizobium japonicum. В результате такого симбиоза бактерии обеспечивают растение связанным азотом, а сами получают от него легко усваиваемые формы углерода, образующиеся при фотосинтезе. После инокуляции растений некоторыми штаммами В. japonicum конечный выход растительной биомассы может возрасти на 25—50% и никаких добавок химически связанного азота больше не потребуется. Примерно 50% сои выращивается в нескольких регионах США, при этом везде используется в общем сходная технология. Но лишь небольшую часть этой культуры в настоящее время обрабатывают В. japonicum. Фермеры до сих пор полагаются на природные штаммы В. japonicum и химические удобрения.

Репутация бактериальных удобрений весьма сомнительна. В 1950-х годах в СССР более 10 млн. га сельскохозяйственных угодий обрабатывались смесью диазотрофных бактерий, состоящей в основном из Azotobacter chroococcum и Bacillus megaterium. При этом примерно в 60% случаев урожайность различных зерновых повысилась на 10—20%. Однако эти полевые испытания оказались некорректными и невоспроизводимыми; многие исследователи выразили сомнения в правильности полученных результатов, и использование бактериальных инокулятов в качестве удобрений не получило развития. Однако проблемы экономического характера, необходимость предотвращения загрязнения окружающей среды, появление новых технологий привели к тому, что ученые вновь обратились к изучению возможности использования бактериальных удобрений.

Микроорганизмы, которые применяются в настоящее время в сельском хозяйстве, принадлежат в основном к двум родам: Rhizobium и Bradyrhizobium. Это грамотрицательные палочкообразные жгутиковые бактерии, находящиеся в симбиозе с бобовыми. Каждый вид Rhizobium и Bradyrhizobium специфичен в отношении лишь небольшого числа видов растений и не взаимодействует с растениями, не являющимися его природными хозяевами (табл. 14.1). На определенной стадии жизненного цикла Rhizobium проникает в клетки корня растения и инициирует комплекс изменений, приводящих к формированию корневого клубенька. Бактерии внутри корневого клубенька быстро пролиферируют и находятся в форме, не имеющей клеточной стенки. Клубеньковые бактерии связывают атмосферный азот с помощью фермента нитрогеназы. Структурные и биохимические взаимодействия между симбионтами — Rhizobium и растением-хозяином — весьма сложны и взаимовыгодны. Внутри клубенька нитрогеназа защищена от токсического действия атмосферного кислорода двумя способами. Во-первых, кислород практически не проникает в клубенек. Во-вторых, содержание кислорода внутри клубенька регулируется белком леггемоглобином. Гемовый компонент этого кислородсвязывающего белка синтезируется бактерией, а глобиновая часть молекулы кодируется геномом растения. Растение обеспечивает бактерии необходимыми для роста связанными формами углерода, образующимися при фотосинтезе, а растение извлекает выгоду из этих симбиотических отношений, получая от бактерии связанный азот.

Таблица 14.1. Специфичность видов Rhizobium и Bmdyrhizobium в отношении разных растений