Молекулярная биотехнология. Принципы и применение - Глик Б., Пастернак Дж. 2002

Молекулярная биотехнология микробиологических систем
Бактерии, стимулирующие рост растений
Гидрогеназа

Нежелательная побочная реакция фиксации азота — восстановление нитрогеназой Н+ до Н2 (газообразный водород), в ходе которой энергия (в форме АТР) расходуется на образование водорода, который в конечном счете просто улетучивается. В результате только от 40 до 60% всего потока электронов, проходящих через нитрогеназный комплекс, передается на N2, что значительно уменьшает эффективность процесса фиксации азота. В принципе, если бы Н2 мог превратиться обратно в Н+, потери энергии были бы ниже, и процесс фиксации азота стал бы более эффективным. Устранить же эту побочную реакцию прямым путем невозможно, поскольку она обусловлена особенностями химического строения активного центра нитрогеназы, и если попытаться блокировать ее, изменив структуру фермента, то неизбежно произойдет и уменьшение активности нитрогеназы.

Метаболизм водорода

В середине 1970-х годов было показано, что некоторые штаммы Bradyrhizobium japonicum могут расти в микроаэрофильных условиях (при низкой концентрации кислорода), используя в качестве источника энергии водород. Для этого они синтезируют фермент гидрогеназу, способную превращать атмосферный Н2 в Н+ (рис. 14.5). Чтобы проверить, можно ли с помощью этих штаммов влиять на рост сои, растения инфицировали В. japonicum, синтезирующими гидрогеназу (Нuр+). Растения давали большую биомассу и усваивали больше азота, чем те, которые были заражены Hup--штаммами, даже несмотря на более высокий уровень нитрогеназной активности последних (табл. 14.3). По результатам этого и аналогичных экспериментов был сделан вывод, что наличие системы ассимиляции водорода у симбиотических диазотрофов типа В. japonicum повышает их способность стимулировать рост растений, по-видимому, в результате связывания и рециркуляции газообразного водорода, образующегося в клубеньках при участии нитрогеназы (рис. 14.5).

Рис. 14.5. Рециркуляция газообразного водорода — побочного продукта фиксации азота. Нитрогеназа катализирует образование водорода, используя энергию гидролиза АТР, а гидрогеназа катализирует его утилизацию.

Несмотря на выгоды, которые получает растение от симбиоза с диазотрофным микроорганизмом, обладающим системой повторного использования водорода, в природных условиях такая система при участии штаммов Rhizobium встречается редко. Согласно результатам тестирования, представленным в табл. 14.4, большинство рассмотренных природных штаммов Rhizobium и Bradyrhizobium имеют фенотип Hup-. Было проверено по несколько штаммов каждого из указанных видов, а для В. japonicum их было более 1400. Ясно, что как только удастся достаточно подробно изучить генетическую природу гидрогеназной системы и идентифицировать соответствующие гены, коммерческие Hup--штаммы Rhizobium будут первыми кандидатами на превращение в штаммы с фенотипом Нuр+.

Модификация генов гидрогеназ

На изучение гидрогеназ как диазотрофных, так и недиазотрофных микроорганизмов в последниe 20 лет было затрачено много усилий, и тем не менее строение и функции этих ферментов до конца не установлены. Многие микроорганизмы синтезируют более одной гидрогеназы, при этом часто они состоят больше чем из одной полипептидной цепи. Одни гидрогеназы только связывают атмосферный водород, в то время как другие при соответствующих условиях могут также синтезировать его. Из всего этого следует, что вряд ли для преобразования штамма Hup- Rhizobium в Нuр+ будет достаточно простого включения в его геном гена одной из гидрогеназ. Включенный ген(ы) должен кодировать все субъединицы фермента, который должен быть совместим с электронтранспортной системой организма-хозяина.

Таблица 14.3. Относительная активность нитрогеназы и гидрогеназы и способность В. japonicum Hup+ (SR) и трех Нuр- -мутантов (SR1, SR2 и SR3) стимулировать рост растений1) 2)

Штамм В. japonicum

Относительная активность нитрогеназы

Относительная активность гидрогеназы

Относительная сухая масса растения

Относительное содержание азота

SR

1,00

1,00

1,00

1,00

SR1

1,27

0,01

0,81

0,93

SR2

1,13

0,01

0,74

0,91

SR3

1,23

0,01

0,65

0,85

1) Из работы Albrecht et al. Science 203: 1255—1257, 1979.

2) Активность нитрогеназы оценивали по зависимости количества ацетилена, восстановленного до этилена, от времени; активность гидрогеназы определяли при помощи водородного электрода. Сухая масса растения включает массу листьев и корней. Содержание азота рассчитывали как долю сухой массы, приходящуюся на азот. Все величины нормированы относительно таковых для родительского штамма.

Таблица 14.4. Доля природных штаммов Rhizobium и Bradyrhizobium, у которых есть система ассимиляции водорода (Нuр+)1)

Бактерия Штаммы Нuр+, %

Rhizobium leguminosarum bv. leguminosarum

9,3

Rhizobium meliloti

21

Rhizobium leguminosarum bv. trifolii

0

Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli

0

Bradyrhizobium japonicum

21

Bradyrhizobium sp.

91

1) Из работы Evans et аl. Літи. Rev. Microbiol. 41: 335—361, 1987

Наиболее распространенная стратегия выделения генов гидрогеназ — генетическая комплементация. Первый из таких генов, ген мембраносвязанной гидрогеназы Е. coli, был идентифицирован методом комплементации у мутантной Е. coli, неспособной синтезировать активную гидрогеназу, с использованием банка клонов ДНК Е. coli дикого типа, созданного с помощью плазмиды pBR322. Мутант, содержащий дефектную мембраносвязанную гидрогеназу, не рос на минимальной среде в присутствии формиата, при этом активность эндоплазматической гидрогеназы оставалась неизменной. Трансформированные клетки, способные расти на такой среде, проверяли на присутствие в них активной гидрогеназы. Трансформант, у которого активность гидрогеназы восстановилась до такого же уровня, как у штамма дикого типа, содержал плазмиду, кодирующую белок мол. массой примерно 60 000 Да, что соответствует мол.

массе одной из субъединиц мембраносвязанной гидрогеназы Е. coli. Дальнейшие исследования показали, что в гидрогеназную систему Е. coli входит множество генов.

Затем были идентифицированы гидрогеназные гены (hup) B.japonicum; для этого использовался банк клонов ДНК дикого типа, созданный с помощью космидного вектора pLAFRl с широким кругом хозяев, и мутанты Hup- В. japonicum. Присутствие гидрогеназы, связывающей атмосферный водород, в трансформированных мутантных клетках Hup- определяли по способности активного фермента восстанавливать метиленовый синий в атмосфере водорода. Более детальное исследование показало, что hup-гены B.japonicum образуют по крайней мере два, а возможно, и три оперона, охватывающих примерно 15 т.п.н., причем hup-гены Rhizobium leguminosarum аналогичны таковым В. japonicum как в отношении нуклеотидной последовательности, так и в том, что касается организации генов. Таким образом, идентифицированные hup-гены B.japonicum можо использовать в качестве гибридизационных зондов для поиска гомологичных генов из банка клонов R. leguminosarum.

После идентификации huр-генов R. leguminosarum, несмотря на всю сложность гидрогеназной системы, удалось «переместить» ее из Hup + -штамма R. leguminosarum в штамм Hup- (табл. 14.5). Растения бобов, на которых образовывали клубеньки бактерии рекомбинантного Нuр+-штамма R. leguminosarum, росли быстрее и содержали больше азота, чем растения, инокулированные Нuр--штаммом (табл. 14.5).

Работы по исследованию генов гидрогеназ не вызвали столь большого интереса, как исследования nif-генов, и тем не менее они убедительно продемонстрировали целесообразность применения методов генной инженерии для повышения способности диазотрофных микроорганизмов стимулировать рост растений. Теперь нужно проверить, приведет ли введение hup-генов в геномы других диазотрофных микроорганизмов (как несимбиотических, так и симбиотических) к такому же эффекту.

Гидрогеназная система может применяться не только для повышения эффективности фиксации азота. Так, очищенную гидрогеназу можно использовать для преобразования и запасания солнечной энергии; регенерации кофакторов, принимающих участие в промышленных ферментативных процессах; синтеза специфических химических соединений, требующего участия Н2 в качестве восстановителя; для удаления трития из воды, которая использовалась для охлаждения реакторов атомных электростанций; для синтеза Н2 из органических отходов; получения водородно-кислородных топливных ячеек. Однако, несмотря на то что уже идентифицировано и охарактеризовано более дюжины генов гидрогеназ, пока ни один из них не использовался для крупномасштабного синтеза этих ферментов.

Таблица 14.5. Рост растений и ассимиляция азота после введения генов hup в Hup- -штамм R. legumirmsarum1)

Фенотип

Относительная сухая масса растения

Относительное содержание азота

Относительная площадь листа

Относительная концентрация азота

Hup-

1,00

1,00

1,00

1,00

Hup+

1,35

1,52

1,53

1,15

1) Из работы Brewin, Johnston, U.S. patent 4,567,146, январь 1986.