Молекулярная биотехнология. Принципы и применение - Глик Б., Пастернак Дж. 2002

Молекулярная биотехнология микробиологических систем
Генная инженерия растений: методология
Бомбардировка микрочастицами

Бомбардировка микрочастицами, или биолистика, — наиболее многообещающий метод введения ДНК в растительные клетки. Золотые или вольфрамовые сферические частицы диаметром 0,4—1,2 мкм покрывают ДНК, осажденной СаС₁₂, спермидином или полиэтиленгликолем, и «выстреливают» ими в клетки из специального «ружья», приводимого в действие газами, образующимися при сгорании пороха, сжатым воздухом или гелием. Частицы разгоняются до скорости 300—600 м/с и пробивают клеточную стенку и мембраны растительной клетки. При этом их плотность такова, что клетки практически не повреждаются.

Попав в клетку, ДНК, покрывающая частицы, каким-то неизвестным способом интегрируется в растительную ДНК. Метод бомбардировки микрочастицами позволяет трансформировать растения самых разных видов, в том числе однодольные и хвойные, в которые не удается ввести ДНК с помощью Agrobacterium.

Бамбардировку микрочастицами можно использовать также для введения чужеродной ДНК в суспензию растительных клеток, культуры клеток, меристематические ткани, незрелые зародыши, протокормы, колеоптили и пыльцу широкого круга растений (табл. 17.3). Кроме того, с помощью этого метода были транспортированы гены в хлоропласта и митохондрии. На поверхность микрочастиц можно осадить плазмидную ДНК, растворенную в буфере. Это позволяет повысить частоту трансформации путем увеличения количества плазмидной ДНК; однако следует иметь в виду, что слишком большие ее количества могут оказаться губительными для клетки.

Таблица 17.3. Трансгенные растения, полученные бомбардировкой различных растительных клеток микрочастицами¹⁾

¹⁾ Из работы Southgate et al, Biotechnol. Adv.. 13, 631—651, 1995.

В трансформированных таким способом клетках, идентифицируемых по экспрессии маркерного гена, введенная ДНК зачастую экспрессируется лишь кратковременно. Пока чужеродная ДНК не встроится в геном растения, она с большой вероятностью утрачивается при делении трансформированных клеток.

Как интеграция, так и экспрессия чужеродных генов может зависеть от конфигурации вектора, используемого для их введения. Например, частота трансформации повышается, если используется линейная, а не кольцевая ДНК. Кроме того, при бомбардировке микрочастицами высокомолекулярные плазмиды (>10 т. п. н.) могут фрагментироваться, поэтому уровень экспрессии чужеродных генов окажется ниже, чем в случае плазмид меньшего размера.