Молекулярная биотехнология. Принципы и применение - Глик Б., Пастернак Дж. 2002

Молекулярная биотехнология микробиологических систем
Генная инженерия растений: методология
Бомбардировка микрочастицами

Бомбардировка микрочастицами, или биолистика, — наиболее многообещающий метод введения ДНК в растительные клетки. Золотые или вольфрамовые сферические частицы диаметром 0,4—1,2 мкм покрывают ДНК, осажденной СаС12, спермидином или полиэтиленгликолем, и «выстреливают» ими в клетки из специального «ружья», приводимого в действие газами, образующимися при сгорании пороха, сжатым воздухом или гелием. Частицы разгоняются до скорости 300—600 м/с и пробивают клеточную стенку и мембраны растительной клетки. При этом их плотность такова, что клетки практически не повреждаются.

Попав в клетку, ДНК, покрывающая частицы, каким-то неизвестным способом интегрируется в растительную ДНК. Метод бомбардировки микрочастицами позволяет трансформировать растения самых разных видов, в том числе однодольные и хвойные, в которые не удается ввести ДНК с помощью Agrobacterium.

Бамбардировку микрочастицами можно использовать также для введения чужеродной ДНК в суспензию растительных клеток, культуры клеток, меристематические ткани, незрелые зародыши, протокормы, колеоптили и пыльцу широкого круга растений (табл. 17.3). Кроме того, с помощью этого метода были транспортированы гены в хлоропласта и митохондрии. На поверхность микрочастиц можно осадить плазмидную ДНК, растворенную в буфере. Это позволяет повысить частоту трансформации путем увеличения количества плазмидной ДНК; однако следует иметь в виду, что слишком большие ее количества могут оказаться губительными для клетки.

Таблица 17.3. Трансгенные растения, полученные бомбардировкой различных растительных клеток микрочастицами1)

Растение(я)

Источник клеток

Кукуруза

Суспензия зародышевых клеток, незрелые зиготические зародыши

Рис

Незрелые зиготические зародыши, зародышевый каллус

Ячмень

Суспензия клеток, незрелые зиготические зародыши

Пшеница

Незрелые зиготические зародыши

Дернообразуюшие злаки

Зародышевый каллус

Рожь

Меристема

Сорго

Незрелые зиготические зародыши

Жемчужное просо

Незрелые зиготические зародыши

Орхидные

Протокормы

Банан

Суспензия зародышевых клеток

Тополь

Каллус

Ель европейская и канадская

Соматические зародыши

Горох

Зиготические зародыши

Огурец

Зародышевый каллус

Батат

Каллус

Клюква

Полученные in vitro части стебля

Пион

Пыльца

Люцерна

Зародышевый каллус

Бобы

Зиготические зародыши

Хлопок

Зиготические зародыши

Виноград

Суспензия зародышевых клеток

Земляной орех

Зародышевый каллус

Табак

Пыльца

1) Из работы Southgate et al, Biotechnol. Adv.. 13, 631—651, 1995.

В трансформированных таким способом клетках, идентифицируемых по экспрессии маркерного гена, введенная ДНК зачастую экспрессируется лишь кратковременно. Пока чужеродная ДНК не встроится в геном растения, она с большой вероятностью утрачивается при делении трансформированных клеток.

Как интеграция, так и экспрессия чужеродных генов может зависеть от конфигурации вектора, используемого для их введения. Например, частота трансформации повышается, если используется линейная, а не кольцевая ДНК. Кроме того, при бомбардировке микрочастицами высокомолекулярные плазмиды (>10 т. п. н.) могут фрагментироваться, поэтому уровень экспрессии чужеродных генов окажется ниже, чем в случае плазмид меньшего размера.