ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ - М. И. Чернявская - 2016

ТЕМА 3. АУТЭКОЛОГИЯ. ВЛИЯНИЕ ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ НА ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ

Осмотическое давление в значительной степени зависит от активности воды (a_w), т. е. количества растворенных в ней веществ. В случае, когда концентрация солей в среде меньше, чем в клетке (гипотонические растворы), вода по градиенту концентрации растворенных веществ стремится внутрь клетки, и осмотическое давление возрастает, что может привести к лизису. Благодаря наличию клеточной стенки такое состояние не является опасным для большинства бактерий. При высоком содержании солей в среде (гипертонические растворы) происходит обезвоживание клеток (плазмолиз) и подавление их роста. Степень подавления роста зависит от типа среды и свойств микроорганизма.

По отношению к солености среды микроорганизмы подразделяют на следующие группы:

✵ пресноводные (негалофильные), в том числе обитатели ультрапресных вод, — развиваются в среде с содержанием солей менее 0,01 % и обычно чувствительны к концентрации NaCl 3,0 %;

✵ морские — как правило, растут в узком диапазоне концентрации соли (2,5 — 5,0 % NaCl); оптимум солености составляет около 3,5 %. Типичными морскими бактериями являются Photobacterium, Vibrio, Alteromonas;

✵ галотолерантные — обычно выдерживают более высокие концентрации солей (до 13,0 % NaCl) и часто обитают в местах с изменяющейся соленостью, например, в почве;

✵ слабогалофильные — растут при 1,5 — 5,0 % NaCl;

✵ умеренные галофилы — растут в диапазоне солености примерно 5,0 — 15,0 % NaCl;

✵ экстремальные галофилы — развиваются при концентрации NaCl от 12,0 — 15,0 % вплоть до насыщенных растворов соли.

Особую группу составляют галоалкалифилы, растущие при высоких концентрациях соды и сочетающие свойства гало- и алкалифилов. Типичными местообитаниями данных микроорганизмов являются высокоминерализованные содовые озера.

Основным механизмом адаптации микроорганизмов к высокому осмотическому давлению окружающей среды служит синтез осмопротекторов (осмолитов) — низкомолекулярных органических соединений, нейтральных по отношению к метаболитам клетки, концентрация которых в цитоплазме уравновешивает внешнее осмотическое давление. К осмопротекторам относятся аминокислоты и их производные (глицин-бетаин, пролин, глутамат), сахара (сахароза, трегалоза), спирты (глицерол, маннитол), гетерогликозиды. Состав осмолитов зависит от концентрации NaCl в среде и не одинаков у разных микроорганизмов, иногда они образуются в значительных количествах. Например, Dunaliella viridisнакапливает до 30 % глицерола от общей массы клетки. Осмолиты хорошо удерживают воду, поэтому применяются в косметической промышленности в составе увлажняющих кремов (например, эктоин из галофильных аноксигенных фототрофов). Адаптация к повышенной солености у экстремально галофильных архей (порядок Halobacteriales) основана на аккумуляции ионов К⁺. Внутриклеточная концентрация ионов калия может быть в 1000 раз выше, чем в окружающей среде, т. е. ферменты галобактерий работают в солевом растворе. Подобная стратегия осмоадаптации обнаружена у некоторых эубак- терий — Salinibacter ruber и представителей порядка Haloanaerobiales. Белки галофилов более «кислые» (содержат много аспартата и глутамата), в них устанавливаются гидрофобные взаимодействия, приводящие к более плотной упаковке глобул. На поверхности клеток работает механизм «белкового щита» (S-слои), когда наружу экспонируются СООН-группы аминокислот, удерживающие ионы Na+. Эти же группы формируют «гидратированную» оболочку клеток за счет электростатического ориентирования диполей воды. Галофилы осуществляют активный транспорт ионов из клетки, поддерживая таким образом определенный «осмостаз».

Для организмов, обитающих на суше, большое значение имеет приспособление к сухости и контакту с воздухом. Условия водного стресса и опасность высыхания создаются на поверхности скал, камней, деревьев, различных сооружений, в почве, особенно почве пустынь. Основным механизмом защиты от высыхания служит образование слизистых капсул и переживающих клеток (спор, конидий, цист). Высокую устойчивость к высыханию обнаруживают некоторые микобактерии с высоким содержанием липидов в клеточной стенке.

Кислотность среды является важным фактором, определяющим существование прокариот. Концентрация ионов водорода, с одной стороны, непосредственно влияет на клетку, ее электрический заряд, состояние мембраны, возможность протекания окислительно-восстановительных реакций; с другой — косвенно, определяя ионное состояние металлов и кислот, их доступность и токсичность.

Значения кислотности среды различных природных вод и растворов, где развиваются микроорганизмы, охватывают почти весь теоретически возможный диапазон рН — от 1 — 2 в кислых источниках до 10 в содовых озерах. По отношению к рН среды микроорганизмы подразделяют на ряд физиологических групп:

✵ нейтрофилы — микроорганизмы, для которых оптимальное значение рН близко к нейтральному (6,0 — 8,0), а рост возможен в диапазоне рН 4,0 — 9,0 (например, Escherichia coli, Bacillus megaterium, Enterococcus faecalis и др.). Большинство природных местообитаний (пресноводные озера и реки, многие почвы, внутренняя среда растительных и животных организмов) имеют близкую к нейтральной реакцию среды; слабощелочной является морская вода;

✵ ацидофилы — микроорганизмы, оптимум рН у которых смещен к области кислотных значений (как правило, ниже 4,0), а рост возможен в диапазоне рН 0 — 5,5. Ацидофильные микроорганизмы делят на облигатные и факультативные, способные расти при нейтральном значении рН среды. Примером ацидофилов служат молочнокислые и уксуснокислые бактерии;

✵ алкалофилы — микроорганизмы, растущие в диапазоне рН 8,5 —11,5, которые также делятся на факультативные (способны расти в нейтральной среде) и облигатные. Примером алкалофилов служат уробактерии и цианобактерии.

Несмотря на экстремальные значения рН окружающей среды, значение внутриклеточного рН достаточно стабильно и поддерживается у алкало- и ацидофильных микроорганизмов на уровне рН ~7,5. Постоянству внутриклеточного значения рН (рН-гомеостаза) способствует низкая проницаемость цитоплазматической мембраны для протонов Н+. Однако, поскольку протоны медленно диффундируют по градиенту концентраций, клетка использует энергозависимые механизмы их выброса. При небольшом закислении среды бактерии применяют антипорт протонов Na⁺ и K⁺. При скачкообразном падении рН включается синтез специальных шаперонов (белков «кислотного шока»), которые предотвращают кислотную денатурацию цитоплазматических белков и восстанавливают конформацию денатурированных белков.

В процессе жизнедеятельности микроорганизмы могут изменять рН среды, продуцируя кислые или щелочные продукты. Например,

E. coli реагирует на повышение кислотности среды синтезом декарбоксилаз аминокислот. Образующиеся в результате амины подщелачивают среду. И наоборот, повышение рН среды стимулирует синтез дезаминаз аминокислот, что ведет к подкислению среды. Яркий пример регулирования рН среды бактериями — двухфазный процесс ацетонобутилового брожения у Clostridium acetobutylicum. Первая фаза — кислотная, в которой при сбраживании глюкозы образуются масляная и уксусная кислоты. Вторая фаза — ацетонобутиловая, в которой по мере подкисления среды (до рН ниже 5,0) индуцируется синтез ферментов, приводящих к образованию и накоплению нейтральных продуктов, в первую очередь н-бутанола, ацетона и этанола.

Микроорганизмы используют энергию окислительно-восстановительных реакций, поэтому одним из важнейших факторов, влияющих на их развитие, является окислительно-восстановительный потенциал среды (Eh). Значение Eh характеризует восстановленность среды и определяет термодинамическую возможность окислительно-восстановительных реакций. Жизнедеятельность микроорганизмов приводит к изменению окислительно-восстановительного потенциала среды. Основными восстановителями в природе служат Н₂ и H₂S, часто образуемые бактериями; главный окислитель — молекулярный кислород. Окислительно-восстановительный потенциал, изменяющийся от -500 до +800 мВ, может служить показателем наличия кислорода в среде: чем больше его отрицательное значение, тем более восстановлена среда (анаэробные условия).

Молекулярный кислород выступает по отношению к микроорганизмам не только как фактор, определяющий окислительно-восстановительные условия среды и возможность протекания химических реакций, но и как важнейший катаболический субстрат, акцептор электронов для аэробных микроорганизмов. Концентрация кислорода в природных местообитаниях варьирует в широких пределах. Атмосферный воздух содержит 21 % кислорода. Растворимость О₂ в воде мала (около 8 мг/л при 20 °С) и значительно снижается с ростом температуры и солености. При наличии в среде легкоокисляемых субстратов, прежде всего органических соединений, кислород быстро потребляется аэробами и в условиях ограниченного обмена с атмосферой становится лимитирующим фактором. Во многих природных местообитаниях (ил, цианобактериальные маты) в пределах долей миллиметра создаются резкие градиенты концентрации О₂, вплоть до полного его исчерпания. Аналогичный перепад концентраций кислорода наблюдается в почве, где в пределах одной почвенной частицы имеются аэробные и анаэробные микрозоны.

По отношению к кислороду микроорганизмы делятся на две группы: аэробы, растущие только при наличии кислорода, и анаэробы, способные расти без него (табл. 4). Среди бактерий и простейших имеются как аэробные, так и анаэробные формы. Грибы — аэробы, хотя некоторые виды, как правило дрожжевые анаморфы, — факультативные анаэробы. Существует небольшое количество и облигатно анаэробных видов.

Таблица 4. Группы микроорганизмов по отношению к молекулярному кислороду

Токсическое действие О₂ на микроорганизмы заключается в инактивации чувствительных к кислороду белков (например, нитрогеназы), а также получении высокореакционных форм кислорода. Образование активных форм кислорода происходит при участии нескольких ферментов:

1) О₂ + 4e- —> 2O^2- (оксид-анион) — цитохромоксидаза, лакказа, тирозиназа;

2) О₂ + 2e^- —> О^2-₂ (Н₂О₂) — флавиновые ферменты (глюкозооксидаза, оксидаза аминокислот, ксантиноксидаза);

3) О₂ + 1e^- —> О₂^- (супероксидрадикал);

4) О₂^- + Н₂О₂ + Н⁺ —> Н₂О + О₂ + ОН (гидроксилрадикал) — альдегидоксидаза, НАДН-оксидаза.

Наиболее часто образующиеся перекись водорода и супероксидрадикал удаляются специальными ферментами.

Каталаза разлагает перекись в реакции 2Н₂О₂ —> 2Н₂О + О₂, пероксидаза — в реакции RH₂ + Н₂О₂ —> R + 2Н₂О, где R — окисленный субстрат пероксидазной реакции.

Супероксидрадикал удаляется супероксиддисмутазой (СОД):

2О₂^- + 2Н⁺ —> Н₂О₂ + О₂.

В присутствии света может образовываться синглетный кислород:

Р + hv —> Р*, Р* + О₂ —> О₂, где Р — пигмент-сенсибилизатор.

Функцию «тушения» синглетного кислорода в клетке выполняют каротиноиды.

У аэробов и факультативных анаэробов в клетках присутствуют СОД, каталаза, пероксидаза, в то время как у облигатных анаэробов данные ферменты отсутствуют. Однако у некоторых метаногенов и кло- стридий обнаружены каталаза и СОД, имеющие важное значение при существовании в условиях нестабильного анаэробиоза. Сульфатредукторы, использующие водород, способны активно бороться с кислородом, осуществляя сульфатное дыхание. Необходимо отметить, что у аэробов также имеются ферменты, чувствительные к кислороду (например, нитрогеназа). В таких случаях клетки обладают определенными механизмами защиты (например, клубеньки — у Rhizobium, капсулы — у Azotobacter, гетероцисты без фотосистемы II — у цианобактерий). Несмотря на токсичность кислорода для облигатных анаэробов, они могут существовать в постоянно аэробных местообитаниях в сообществе с аэробными и факультативно анаэробными микроорганизмами, которые поглощают О₂. Примерами таких сообществ являются цианобактериальные маты, где верхний слой аэробный и оксигенный, а нижний — анаэробный; микробиота ротовой полости, где облигатно анаэробные бактерии Porphyromonas gingivalis обитают в отложениях зубного камня.

Контрольные вопросы

1. Какое воздействие на микроорганизмы оказывают гипо- и гипертонические условия окружающей среды?

2. На какие физиологические группы делят микроорганизмы по отношению к солености среды?

3. Назовите механизмы адаптации микроорганизмов к обитанию в условиях повышенного осмотического давления среды.

4. На какие группы делят микроорганизмы по отношению к кислотности среды? Приведите примеры представителей каждой группы.

5. Назовите основные механизмы поддержания внутриклеточного рН-гомеостаза в бактериальной клетке.

6. Какие группы микроорганизмов выделяют по отношению к кислороду?

7. Чем обусловлено токсическое действие кислорода на клетки микроорганизмов?

8. Перечислите механизмы защиты микроорганизмов от высокореакционных форм кислорода.

Лабораторная работа 5. Влияние осмотического давления кислотности среды на рост микроорганизмов

Цель работы: изучить рост микроорганизмов различных систематических групп на питательных средах с разной кислотностью и соленостью (осмотическим давлением).

Материалы и оборудование: ПДБ с различными значениями рН (3,0; 5,0; 7,0; 8,0; 9,0; 10,0), ПДА с добавлением 0,5, 5, 10, 15 % NaСI, автоматический дозатор на 2 — 20 мкл, стерильные пипетки на 1 — 2 мл, наконечники на 10 — 200 мкл, микробиологическая петля, спектрофотометр или фотоэлектроколориметр, спиртовка, термостат.

Ход работы

1. Влияние осмотического давления на рост микроорганизмов.

1) Культуры исследуемых бактерий штрихом засевают на чашки Петри с ПДА с добавлением 0,5, 5, 10, 15 % NaСl.

2) Чашки инкубируют при температуре 28 — 37 °С в течение 48 — 72 ч.

3) Результаты учитывают визуально, сравнивая рост бактерий на чашках с разной концентрацией NaСl. Результаты вносят в таблицу (табл. 5).

4) Делают вывод об устойчивости исследуемых штаммов микроорганизмов к солености среды.

Таблица 5. Рост исследуемых микроорганизмов при разных концентрациях NaCl

Примечание: «+++» — хороший рост, «++» — умеренный рост, «+» — слабый рост, «—» — отсутствие роста.

2. Рост микроорганизмов при разных значениях рН среды.

1) Накануне занятия исследуемые культуры бактерий засевают в ПДБ и культивируют при оптимальной температуре в течение 24 — 48 ч.

2) По 10 мкл выросшей культуры вносят в шесть пробирок, содержащих 2 мл ПДБ с разными значениями рН (3,0; 5,0; 7,0; 8,0; 9,0; 10,0). Необходимо, чтобы начальное количество клеток во всех пробирках было одинаковым.

3) Пробирки с изучаемыми культурами инкубируют при оптимальной температуре в течение 24 — 48 ч.

4) Учет результатов проводят с использованием спектрофотометра или фотоэлектроколориметра. Показатель оптической плотности культуры сравнивают с оптической плотностью ПДБ с соответствующим значением рН (контроль). Измерения проводят при длине волны 600 нм (ОП₆₀₀).

5) По результатам измерений строят график (рис. 5).

Рис. 5. Показатели накопления биомассы бактериальных культур в зависимости от рН питательной среды (24 ч культивирования)

6) Делают вывод об оптимальном значении рН для роста исследуемых микроорганизмов.