ОБЩАЯ И ПИЩЕВАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ ЧАСТЬ II - Л. В. Красникова - 2016

ТЕМА 10. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ХЛЕБОПЕКАРНОГО ПРОИЗВОДСТВА

10.1. Микробиологический контроль зерна

Микроорганизмы зерна представлены разными видами бактерий, дрожжей, мицелиальных грибов. Среди них различают сапрофитные, фитопатогенные и патогенные для человека микроорганизмы. Микроорганизмы, размножающиеся на поверхности растений и не причиняющие им вреда, называются эпифитными.

Эпифитную микрофлору свежеубранного зерна составляют бактерии вида Ervinia herbicola (до 70-95 % от общего количества бактерий). В меньших количествах присутствуют бактерии вида Pseudomonas fluorescens. При закладке на хранение сильно запыленного зерна или собранного в жаркий сухой период существенно возрастает доля спорообразующих бактерий видов Bacillus subtilis, B. mycoides, B. licheniformis, B. megatherium и др. На поврежденном зерне могут присутствовать бактерии родов Micrococcus, Sarcina, Lactobacillus, Proteus.

Дрожжи, встречающиеся на поверхности зерна, относятся к родам Saccharomyces, Candida, Torulopsis и не оказывают существенного влияния на качество злаков, однако при повышении влажности они способствуют самосогреванию зерна и появлению так называемого «амбарного» запаха.

Мицелиальные грибы всегда являются сопутствующей микрофлорой зерна. Их развитие приводит к уменьшению массы сухих веществ зерна и существенному снижению его качества. Среди плесневых грибов различают полевые грибы и грибы хранения.

К первой группе относятся грибы родов Alternaria, Fusarium, Helmintosporium. Мицелий этих грибов проникает в зародыш зерна в стадии молочной спелости и затем в эндосперм. В результате их развития образуются щуплые, пятнистые зерна с черным зародышем. Вторая группа грибов обнаруживается на хранящемся зерне и не встречается на свежеубранном. К ней принадлежат грибы родов Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus, Cladosporium, Trichoderma, Trichothecium, Thamnidium и др.

Фитопатогенные микроорганизмы паразитируют на растениях, вызывая различные их заболевания. Мицелиальные грибы вызывают такие заболевания зерна, как спорынья, головня, фузариоз. (Подробное описание этих возбудителей дано в учебном пособии, часть I).

Определение общего количества микроорганизмов в зерне

Отбор проб. С помощью специальных приборов - щупов отбирают точечные пробы зерна. Точечная проба - это проба зерна, отобранная от партии за один прием из одного места. Точечные пробы осматривают на предмет однородности. Если они достаточно однородны, то их смешивают, составляя объединенную пробу. Далее из объединенной пробы выделяют среднюю пробу с помощью делителя или вручную.

Проведение анализа. Из средней пробы зерна отвешивают навеску массой 10 г в стерильных чашках или бюксах и быстро их закрывают. Навеску переносят в колбу с 90 см³стерильной воды. Колбу тщательно встряхивают в течение 5 мин вручную или на специальном лабораторном аппарате. Из полученного таким образом первого разведения готовят последующие. Разведение 10^-2 используют для определения мицелиальных грибов, а разведения 10^-3 и 10^-4 - для определения бактерий. Высев разведений производят параллельно в две стерильные чашки Петри глубинным способом (по 1 см³ на дно пустой стерильной чашки, которую потом заливают остуженным питательным агаром) или поверхностным способом (по 0,2-0,5 см³ на поверхность застывшего агара в чашке Петри). Для определения бактерий используют мясопептонный агар, а для определения дрожжей _ сусло-агар или среду Сабуро. Засеянные чашки термостатируют при температуре 25-30 °С в целях определения бактерий и при температуре 22-25 °С - для определения дрожжей и мицелиальных грибов. Через 48 ч подсчитывают число выросших колоний, готовят из них микроскопические препараты для выяснения представителей доминирующей микрофлоры исследуемого зерна.

10.2. Микробиологический контроль муки

Содержание микроорганизмов в муке обычно зависит от их исходного количества в зерне, способа очистки зерна, сорта муки и условий ее хранения. В сухой муке микроорганизмы находятся в состоянии анабиоза, так как для их развития требуется наличие свободной воды. При длительном хранении муки в хороших условиях общее количество микроорганизмов постепенно уменьшается за счет отмирания неспорообразующих форм бактерий. При увлажнении муки на 1-2 % выше допустимой нормы жизнедеятельность микробов восстанавливается, они начинают размножаться, и мука подвергается микробиологической порче: происходит ее прокисание, прогоркание, плесневение.

Определение общего количества микроорганизмов в муке

Каждая партия муки, поступающая на предприятие, сначала подвергается органолептической оценке. В случае обнаружения постороннего плесневого запаха, кисловатого или прогорклого вкуса готовят навеску муки и определяют общее количество микроорганизмов по методике, аналогичной анализу зерна.

Определение количества спорообразующих бактерий в муке

Спорообразующие бактерии видов Bacillus subtilis (сенная палочка), Bacillus licheniformis (картофельная палочка), Bacillis mycoides (грибовидная палочка) и некоторые другие вызывают порчу хлебобулочных изделий из пшеничной муки, называемую картофельной болезнью. При выпечке хлеба вегетативные клетки этих бактерий погибают, а их споры сохраняют свою жизнеспособность при температуре мякиша 95-97 °С. Для определения спор бактерий в муке используют микробиологический метод или метод пробных выпечек.

Микробиологический метод. Из средней пробы муки взвешивают навеску массой 10 г и размешивают ее, затем переносят в колбу с 90 см³ стерильной воды, получая таким образом разведение 10^-1. Подготовленную пробу тщательно перемешивают и прогревают в водяной бане с температурой 90-95 °С в течение 10 мин. Затем содержимое колбы охлаждают и приготавливают из него разведение 10^-2. Из разведений 10^-1 и 10^-2 отбирают пипеткой по 1 см и высевают глубинным способом в чашки Петри, используя в качестве питательной среды мясопептонный агар или дрожжевой агар с 2 % сахарозы (рН среды 7,0-7,2). Чашки выдерживают в термостате при температуре 25-30 °С в течение 2-3 сут, после чего подсчитывают число выросших на них колоний. При содержании в 1 г муки менее 200 спорообразующих бактерий она считается нормальной, от 200 до 1000 - сомнительной, а свыше 1000 - сильно контаминированной этими микроорганизмами.

Метод пробных выпечек. Пшеничную муку с мая по октябрь исследуют на присутствие в ней спорообразующих бактерий. Из исследуемой муки замешивают на дрожжах тесто и изготавливают из него три одинаковых по массе формовых хлебца. После выпечки хлеб охлаждают, пробные образцы заворачивают в увлажненную плотную бумагу, помещают их в эксикатор и выдерживают в термостате при температуре 37 °С. Через 24 ч первый образец вынимают из термостата, надрезают и органолептически устанавливают наличие признаков заболевания его картофельной болезнью (специфический запах, липкий мякиш, появление серебристых нитей при разламывании). Через каждые последующие 24 ч надрезают второй и третий хлебцы. При наличии признаков порчи через 72 ч мука считается доброкачественной. В случае порчи пробного хлебца через 24 ч мука сильно контаминирована спорообразующими бактериями и допускается в производство с определенными ограничениями.

10.3. Микробиологический контроль прессованных дрожжей

Микроскопирование. Качество прессованных дрожжей оценивают по величине и однородности клеток и наличию посторонних микроорганизмов в микроскопическом препарате. Одну петлю дрожжей вносят в пробирку с небольшим количеством стерильной воды и размешивают. Каплю полученной суспензии наносят на предметное стекло, смешивают с метиленовым синим, накрывают покровным стеклом и рассматривают с иммерсионным объективом. Определяют морфологическое состояние дрожжевых клеток, процент мертвых клеток, наличие клеток несовершенных дрожжей и бактерий. В хороших дрожжах количество посторонних микроорганизмов не должно превышать 10-15 %.

Определение процентного содержания дрожжей сахаромицетов и посторонних микроорганизмов

В случае снижения подъемной силы или стойкости прессованных дрожжей проводят определение их микробиологического состава и степень контаминации посторонними микроорганизмами. Для этого используют упрощенный или усложненный метод (метод ЛО ВНИИХПа).

Упрощенный метод. Готовят десятикратные разведения навески прессованных дрожжей массой 1 г (10^-5 -10^-7) и высевают по 1 см в чашки, используя в качестве питательной среды сусло-агар с мелом и нистатином для выявления кислотообразующих бактерий. После

термостатирования при температуре 30 °С в течение 48-72 ч чашки просматривают и подсчитывают число колоний с зонами просветления на белом фоне среды. Число колоний умножают на соответствующее разведение.

Усложненный метод предусматривает посев дрожжей на несколько элективных сред для выявления разных групп вредных микробов. Схема посева по методу ЛО ВНИИХПа представлена в табл. 10.1.

Таблица 10.1. Схема посева приготовленных разведений прессованных дрожжей на элективные среды (по 0,1 см³ в каждую чашку)

Согласно этому методу, из пробы прессованных дрожжей, взятой из середины бруска, берут навеску массой 1 г и вносят ее в колбу со 100 см стерильной воды. После тщательного размешивания из полученного разведения 10^-2 делают ряд последующих разведений (10^-3-10^-8).

Соответствующие разведения высевают в чашки Петри на указанные в табл. 10.1 питательные среды. После термостатирования чашек с посевами при оптимальной для каждой группы микроорганизмов температуре подсчитывают число выросших колоний. Общее количество колоний дрожжей сахаромицетов принимают за 100 % и определяют процентное содержание посторонних дрожжей, мицелиальных грибов, гнилостных, молочнокислых, спорообразующих бактерий и кишечных палочек.

Присутствие в дрожжах бактерий вида Proteus vulgaris определяют методом Шукевича - посевом капли 1-го и 2-го разведений дрожжей в конденсационную воду скошенного мясопептонного агара в пробирках. Посевы ставят в термостат с температурой 37 °С на 24-48 ч. Палочку протея обнаруживают по тонкому полупрозрачному налету, застилающему всю поверхность агара и поднимающемуся по стенке пробирки.

В доброкачественных прессованных дрожжах допускается присутствие посторонних дрожжей не более 10 %, молочнокислых бактерий - в пределах 15-35 %, гнилостные бактерии, протеи и бактерии группы кишечной палочки не должны присутствовать.

10.4. Микробиологический контроль теста

В тесте помимо дрожжей сахаромицетов и молочнокислых бактерий, вносимых с прессованными жидкими дрожжами и заквасками, могут встречаться посторонние микроорганизмы. Их условно подразделяют на три группы:

1. Микроорганизмы сапрофиты, не влияющие на процесс брожения теста. К ним относятся микрококки и сарцины, присутствующие в муке.

2. Микроорганизмы, нарушающие нормальный ход брожения теста и ухудшающие качество готового хлеба. Это, главным образом, несовершенные дрожжи родов Candida (Candidautilis, C. mycoderma, C. guilliermondi, C. crusei), Torulopsis, а также некоторые виды бактерий - Leuconostoc mesenteroides, Bacillus coagulans. Источниками несовершенных дрожжей являются мука, прессованные дрожжи, молочная сыворотка. Несовершенные грибы понижают мальтазную активность прессованных дрожжей, ухудшают их подъемную силу, конкурируют за питательные вещества с бродильной микрофлорой. В ржаных заквасках, контаминированных грибами рода Candida, появляются неспецифический запах и горьковатый привкус. Развитие B. coagulans может привести к накоплению кислоты, повлению сырного запаха. Leuconostoc mesenteroides накапливает полисахариды, что приводит к образованию слизи в жидких заквасках с заваркой.

3. Микроорганизмы, вызывающие микробиологическую, порчу готовых изделий.

Качественный состав микрофлоры теста определяют путем высева разведений проб на элективные среды аналогично методу ЛО ВНИИХПа (см. табл. 10.1). В процессе созревания теста следят за газообразующей способностью дрожжей, степенью их размножения, активностью молочнокислых бактерий.

Газообразующую способность дрожжей в тесте, мальтазную активность и осмочувствительность дрожжей определяют в микрогазометрическом приборе И. К. Елецкого.

Степень размножения дрожжей определяют в счетной камере Горяева: исследуемый материал предварительно обрабатывают по методу Гуторова раствором щелочи с последующей окраской метиленовым синим. Количество дрожжевых клеток по мере созревания теста увеличивается. Так, при замесе теста количество дрожжевых клеток в 1 г теста составляет около 70 млн, в конце процесса созревания - 112-117 млн; при использовании жидких дрожжей количество дрожжевых клеток в тесте намного меньше и составляет около 20-25 млн в 1 г.

Определение активности молочнокислых бактерий

Активность молочнокислых бактерий определяют по методу Г.М. Смирновой и М.П. Юргенсон, наблюдая за скоростью восстановления сине-зеленой краски янус-грюн или метиленового синего. Для этого 20 г теста смешивают с 40 см³ воды, нагретой до температуры 40 °С. Из смеси, отбирают две пробы по 10 мл. В одну пробирку (опытную) добавляют 1 см³ 0,05 %-го водного раствора янус-грюн (или метиленового синего). Вторая пробирка служит контролем. Пробирки помещают в термостат с температурой 40 °С. Активность молочнокислых бактерий определяют по времени, необходимому для обесцвечивания краски: низкая - 90-100 мин, высокая - 35-50 мин, очень высокая - 7-25 мин.

10.5. Контроль заквасок, используемых в хлебопечении

В хлебопекарной промышленности для улучшения хлебопекарных свойств и повышения качества продукции при изготовлении пшеничного и ржаного хлеба используют закваски на основе чистых культур молочнокислых бактерий или их комбинаций.

К микроорганизмам заквасок должны предъявляться следующие требования:

✵ они должны хорошо размножаться в мучных средах;

✵ должны иметь определенный уровень ферментативной активности;

✵ быть стабильными при непрерывном культивировании;

✵ обладать антагонистической активностью по отношению к технически вредной микрофлоре;

✵ синтезировать определенные витамины.

Микробиологический состав заквасок для производства изделий из пшеничной и ржаной муки различен, в их состав, как правило, входят различные штаммы дрожжей, молочнокислых, пропионовокислых бактерий.

Закваски для пшеничного теста

Использование заквасок в технологии хлеба из пшеничной муки позволяет предупредить развитие картофельной болезни, повысить пищевую и биологическую ценность готовых изделий, улучшить их органолептические показатели.

В табл. 10.2. приведен микробиологический состав заквасок, используемых для хлебобулочных изделий из пшеничного теста.

Таблица 10.2. Микробиологический состав заквасок для пшеничного теста

Пшеничная мезофильная закваска применяется с целью интенсификации процесса газообразования в тесте, сокращения продолжительности брожения, улучшения качественных показателей готовых изделий из пшеничной муки. Эту закваску готовят путем выращивания дрожжей в осахаренной заварке совместно с мезофильными молочнокислыми бактериями при температуре 28-32 °С.

Комплексная закваска рекомендуется к применению в следующих случаях: для улучшения качества изделий из муки со слабой клейковиной, для обеспечения микробиологической чистоты изделий с добавлением пшеничных отрубей, при ускоренном способе приготовления теста. Закваска готовится на водно-мучной среде при соотношении воды и муки 3:1 и температуре культивирования в пределах 30-32 °С.

Ацидофильная закваска применяется для улучшения качества изделий из муки с крепкой и крошащейся клейковиной, в ускоренных технологиях приготовления теста, в производстве сдобных изделий с высоким содержанием сахара и жира.

Пропионовокислая закваска используется с целью предупреждения развития картофельной болезни и плесневения хлеба. Входящие в состав закваски пропионовокислые бактерии обладают способностью синтезировать витамин В₁₂, который принимает участие в процессе кроветворения.

Витаминная закваска рекомендуется для улучшения качества изделий из муки со слабой клейковиной, а также для повышения биологической ценности хлебобулочных изделий за счет обогащения продукта β-каротином, который синтезируют дрожжи Burella armenioka Сб-206. Закваску готовят на мучной осахаренной заварке влажностью 82-85 % при температуре 22-25 °С в течение 5-6 ч.

Эргостериновая закваска позволяет повысить биологическую ценность готовых изделий за счет увеличения содержания в них эргостерина (до 0,2-0,3 мг/100 г), синтезируемого гибридным штаммом дрожжей Saccharomyces cerevisiae 576. Закваску готовят путем совместного культивирования дрожжей и молочнокислых бактерий при температуре 30-32 °С с циклическим отбором и возобновлением через каждые 4 ч. Применение эргостериновых заквасок рекомендуется в экологически неблагополучных регионах.

Закваски для ржаного теста

При приготовлении ржаного теста в начале процесса необходимо вносить в том или ином виде специфические кислотообразующие бактерии и дрожжи в необходимом соотношении. Необходимое соотношение дрожжей и кислотообразующих бактерий достигается приготовлением ржаного теста на различных заквасках.

Тесто для ржаного хлеба можно готовить на:

✵ густой закваске;

✵ жидкой закваске без заварки;

✵ жидкой закваске с заваркой;

✵ концентрированной бездрожжевой молочнокислой закваске (КМКЗ).

Густая закваска используется для приготовления теста из ржаной обойной и обдирной муки, а также из смеси разных сортов ржаной и пшеничной муки. Густая закваска должна иметь влажность 48-50 %, подъемную силу до 25 мин, кислотность 13-14 град, если готовится из ржаной обойной муки или 11-14 град - из ржаной обдирной муки. Закваску готовят на чистых культурах молочнокислых бактерий: Lactobacillus plantarum 63, L. brevis 5, L. brevis 78 в сочетании со штаммом дрожжей Candida milleri «Чернореченский», выращенным на солодовом сусле. Для выведения густой закваски используют также лактобактерин, представляющий собой высушенную сублимационным методом биомассу смеси вышеуказанных штаммов молочнокислых бактерий и чистую культуру дрожжей Candida milleri «Чернореченский» в виде смыва с поверхности скошенного суслоагара. При выведении густой закваски с небольшой массой (до 5 кг) три дозы сухого лактобактерина разводят в 30 см³ стерильной воды с предварительной активацией в течение 3-4 ч при температуре 33-35 °С в питательной смеси из 0,45 кг муки и 0,5 дм³ воды. Активированный лактобактерин тщательно смешивают с суспензией дрожжей (10 см³), смытой из пробирки со скошенным сусло-агаром, или с суспензией прессованных дрожжей (1 г в 10 см³ воды). Микроорганизмы вносят в питательную смесь из 1,8 кг муки и 2,19 дм³ воды для получения 5 кг закваски I фазы, затем II и III фаз разводочного цикла с соблюдением технологических параметров. Выброженную закваску III фазы переносят в дежу и накапливают до нужного количества путем освежений.

Жидкая закваска без заварки используется для приготовления теста из ржаной и смеси разных сортов ржаной и пшеничной муки. Эта закваска должна иметь влажность 70-75 %, кислотность 9-13 град при подъемной силе до 35 мин. Технология закваски подразделяется на два цикла - многоступенчатый разводочный и производственный. В разводочном цикле жидкую закваску выводят с применением смеси чистых культур дрожжей Saccharomyces cerevisiae Л-1 и Candida milleri «Чернореченский» в сочетании со смесью жидких культур Lactobacillus plantarum 30, L. rhamnosus 26, L. brevis 1, L. fermentum 34 или сухого лактобактерина для жидких хлебных заквасок из смеси этих же штаммов. Выведение жидкой закваски можно начинать с большой массы непосредственно в цехе или с небольшой массы (5 кг в I фазе) в лаборатории.

В разводочном цикле закваску готовят на водно-мучной среде при соотношении ржаной муки и воды 35:60. Температура брожения поддерживается в пределах 28-30 °С; продолжительность процесса составляет 2,5-3 ч, конечная кислотность закваски - 8,0-8,4 град, подъемная сила - 30-35 мин. В этом цикле вместо жидких культур молочнокислых бактерий можно использовать сухой лактобактерин для жидких заквасок. В производственном цикле часть закваски используется для приготовления ржаного теста, а оставшуюся часть направляют для производства новой порции закваски. Далее в производственном цикле используется полунепрерывный способ культивирования микроорганизмов закваски, при котором через каждые 3-4 ч отбирают определенный объем закваски с кислотностью 9-13 град и добавляют такой же объем свежей питательной среды.

Жидкая закваски с заваркой. Технология этой закваски отличается от технологии жидкой закваски без заварки тем, что для ее разведения готовят питательную смесь из муки и заварки, затем в нее вносят вышеуказанные культуры микроорганизмов и после перемешивания оставляют для брожения на 7-9 ч до достижения кислотности 7-9 град. Разводочный цикл состоит из трех фаз, после чего следует производственный цикл приготовления закваски. Готовая закваска с заваркой должна иметь влажность 80-85 %, кислотность 9-12 град, подъемную силу до 30 мин.

Концентрированная молочнокислая закваска (КМКЗ) готовится в разводочном цикле с применением смеси штаммов молочнокислых бактерий: L. plantarum 30, L. rhamnosus 26, L. brevis 1, L. fermen- tum 34 или сухого лактобактерина для жидких ржаных заквасок. Закваска должна иметь влажность 60-70 %, температуру 37 — 41 °С, кислотность 18-24 град. Тесто готовят в две стадии (КМКЗ —» тесто) или в три стадии (КМКЗ —» опара —» тесто). При замесе теста на КМКЗ в качестве биологических разрыхлителей используют прессованные или жидкие дрожжи. Приготовление теста на концентрированной молочнокислой бездрожжевой закваске рекомендуется для предприятий с двухсменным режимом работы или для малых пекарен, вырабатывающих хлеб из ржаной муки или смеси разных сортов ржаной и пшеничной муки всего несколько часов в сутки.

10.6. Микробиологический контроль хлебобулочных изделий

Обнаружение контаминации поверхности хлеба бактериями кишечной палочки (БГКП). На поверхность хлеба накладывают стерильный трафарет размером (10 x 10 см) и внутреннюю поверхность квадрата протирают ватным тампоном, смоченным в стерильной воде. Тампон помещают в пробирку со стерильной водой, из которой делают высев на поверхность среды Эндо в чашке Петри. Наличие БГКП на поверхности хлеба не допускается.

Определение спорообразующих бактерий в хлебе. Из мякиша пшеничного хлеба стерильным ланцетом вырезают кусочек массой 10-20 г, помещают его в стерильную колбу, заливают 100 см³ стерильной воды и в течение 5 мин тщательно встряхивают. Из полученной взвеси готовят десятикратные разведения (10^-1-10^-3), после

чего по 1 см³ каждого разведения высевают в пробирки с мясопептонным бульоном. Посевы выдерживают в термостате при температуре 37±1 °С в течение 48 ч.

Изделия из пшеничного теста режут на ломти толщиной 2-3 см, раскладывают их в чашки Петри и стерилизуют в автоклаве при давлении 0,15 МПа в течение 20 мин. После охлаждения на поверхность ломтей наносят по 10 см³ культуры микроорганизмов, выросших в мясопептонном бульоне. Чашки с ломтями помещают в эксикаторы, на дно которых наливают воду и ставят их на двое суток в термостат с температурой 37±1 °С. При наличии в исследуемом хлебе аэробных спорообразующих бактерий наблюдается ослизнение и потемнение ломтей и присутствие специфического запаха. Оценку хлеба производят следующим образом: хлеб с титром 10^-1 контаминирован спорообразующими бактериями слабо; с титром 10^-2- средне; с титром 10^-3 - сильно.

Задание по теме:

1. Провести определение общего количества микроорганизмов в зерне и в муке.

2. Провести определение спорообразующих бактерий в муке микробиологическим методом.

3. Провести микробиологический контроль прессованных дрожжей.

4. Подсчитать в камере Горяева число мертвых и почкующихся клеток в прессованных дрожжах.

5. Определить степень размножения дрожжей в тесте путем подсчета их клеток в камере Горяева.

6. Определить активность молочнокислых бактерий в тесте методом Смирновой и Юргенсон.

7. Ознакомиться с заквасками, применяемыми в хлебопечении, рассмотреть их микроскопические препараты.

Контрольные вопросы

1. Перечислите виды бактерий _ представителей эпифитной микрофлоры зерна.

2. Какие мицелиальные грибы относят к полевым грибам зерна, а какие к грибам хранения?

3. Какие методы используются для определения спор бактерий в муке?

4. Какие посторонние микроорганизмы выявляют в прессованных дрожжах?

5. Какие показатели используют для микробиологического контроля теста?

6. Какие требования предъявляются к закваскам для хлеба?

7. Назовите закваски для пшеничного теста и их видовой состав.

8. Назовите закваски для ржаного теста и их видовой состав.

9. Как проводят микробиологический контроль готовых хлебобулочных изделий?