РОСТ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ БИООБЪЕКТОВ - В. М. Самыгин - 2016

ГЛАВА 3. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ КАК ОСНОВА ПРОЦЕССОВ РОСТА И РАЗМНОЖЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Одним из наиболее важных методов микробиологического исследования является метод выделения чистых культур, позволяющий изолировать отдельные виды микроорганизмов из той или иной среды их обитания. Введение в практику метода микробиологического исследования принадлежит Л. Пастеру и основано на применении жидких питательных сред, которые обеспечивают выделение возбудителя преимущественно из материала, содержащего один вид микроорганизма (например, из крови). Разделение бактериальных смесей и изолированное изучение отдельных видов стало возможным благодаря усовершенствованию метода выделения чистых культур Р.Кохом, применившим для этой цели в 1881 году плотные питательные среды, на которых при посеве удается распределить материал таким образом, что микробные клетки располагаются отдельно друг от друга.

При соответствующих условиях (питательная среда, оптимальная температура) размножение клеток дает потомство одного и того же вида, то есть чистую культуру данного вида микроорганизмов, формируемых в виде заметных невооруженным глазом колоний. Для изолирования микробов Р. Кох применял желатину, недостатком которой является ее расплавление при 25 °С. Предложенная Ангелиной Гессе в 1882 году в лаборатории Р. Коха плотная питательная среда на основе агар-агара, плавящаяся лишь при высокой температуре, оказалась более удобной и быстро получила широкое распространение, оставаясь универсальной средой до настоящего времени.

Для выделения чистых культур, в том числе патогенных микроорганизмов, и их последующей идентификации используют диагностические питательные среды. Применение диагностических питательных сред основано на многообразии ферментных систем, присущих различным патогенным микроорганизмам, а также на их различных морфологических и культуральных свойствах. Диагностические среды должны обладать высокой чувствительностью и элективностью и обеспечивать при этом отчетливую дифференциацию отдельных микроорганизмов. В более широком представлении в соответствии с задачами исследования среды классифицируются по нескольким категориям.

3.1. Классификация питательных сред

А) По назначению выделяют: среды консервирования, среды обогащения, среды для культивирования, элективные среды, дифференциальнодиагностические среды.

Среды консервирования используют для первичного засева и транспортировки исследуемого материала и имеют цель, с одной стороны, предотвращать отмирание патогенных микробов, а с другой - добиться подавления сапрофитной флоры. В качестве примера - глицериновая смесь для кишечной группы бактерий.

Среды обогащения применяют с целью накопления какой-либо одной группы микроорганизмов. При определении состава среды создаются оптимальные условия для выращивания этой группы при задержке роста сопутствующей флоры, что дает возможность повысить процесс положительных результатов исследования. Например, пептонная вода для холерного вибриона или селенитовая среда для кишечной группы.

Среды для культивирования, которые включают универсальные простые или сложные специальные среды. Эти среды используют при получении биомассы микроорганизмов, продуктов микробного синтеза, например, токсинов, антигенов, ферментов и т. д.

Элективные среды используются для посева исходного материала с целью получения в дальнейшем чистых культур. При приготовлении этих сред исходят из различных биохимических и энергетических свойств микробов, благодаря чему при строго определенном составе среды, рН, концентрации отдельных микроэлементов создаются условия, благоприятствующие росту отдельных групп 31 микроорганизмов и задерживающие рост других. Сюда же относятся среды для получения конкретных целевых продуктов.

Дифференциально-диагностические среды применяют для изучения и идентификации отдельных родов или видов микроорганизмов. Сюда входят среды с углеводами и спиртами, мочевиной, среды для определения индолобразования и протеолитической активности, комбинированные среды, среды с органическими кислотами, среды для определения токсигенности, подвижности бактерий и т. д.

Б) По загрязненности материала выделяют простые среды, если материал слабо загрязнен, а также специальные или элективные (для отдельных видов) и селективные (только для отдельных бактерий).

В) По составу среды характеризуют с учетом питания микроорганизмов.

Известно, что для роста микроорганизмов необходимы питательные вещества, из которых микроорганизмы строят свои клетки и получают энергию. В принципе питательные среды должны отвечать следующим минимальным требованиям: в них должны присутствовать все элементы, из которых строится клетка, причем в такой форме, в какой микроорганизмы способны их усваивать.

Для построения белков клетки требуются, прежде всего, азот, углерод, водород и кислород. Для хорошего роста большинства микробов необходимо содержание в 100 мл бульона не менее 250-300 мг общего азота при наличии в этом количестве аминного азота (азота аминокислот), по крайней мере, 25-30 %.

Помимо элементов минерального питания и источников углерода и энергии, многие организмы нуждаются еще в некоторых дополнительных веществах, называемых факторами роста. Эти вещества входят в состав микробной клетки, однако некоторые микроорганизмы не способны самостоятельно их синтезировать. К числу факторов роста относятся аминокислоты, пурины, пиримидины, которые являются составными частями белков и нуклеиновых кислот, а также витамины, входящие в состав коферментов или простетических групп и таким образом участвующие в каталитических функциях. Организмы, нуждающиеся в факторах роста, называют ауксотрофными в противоположность прототрофным микроорганизмам, которым такие факторы не требуются.

Очень многие нетребовательные микроорганизмы, например, большинство живущих в воде и почве псевдомонад, а также кишечная палочка Escherichia coli, хорошо растут на глюкозо-минеральных средах. Если питательные компоненты состоят из химически определенных соединений, то говорят о синтетической среде. Более требовательные виды нуждаются в большом числе добавочных веществ, причем потребности в таких веществах не всегда хорошо известны. В связи с этим для культивирования микроорганизмов используют среды на основе мяса, казеина, рыбы, дрожжей, крови животных и другие высоко питательные среды, в которые для уменьшения их стоимости часто добавляют вместо чистых соединений весьма сложные смеси, в том числе отходы различных производств (мясомолочной промышленности, растительные отходы и др.). Такого рода питательные среды называют сложными. Иначе говоря, по своему составу выделяют синтетические (минеральные), полусинтетические и белковые среды.

Г) В зависимости от физических данных (консистенции) питательные среды делят на жидкие, полужидкие и плотные (твердые). Для приготовления плотных сред к жидким питательным растворам добавляют особые вещества, которые придают им желеобразную консистенцию. Желатину для этой цели применяют лишь в отдельных случаях, так как она имеет слишком низкую точку плавления (25-30 °С) и, кроме того, разжижается (утилизируется) многими микроорганизмами. Почти идеальным средством для получения плотных сред является агар-агар, представляющий собой полисахарид сложного состава из морских водорослей, в сильной степени поперечносшитый. Плавится агар только при температуре близкой к 100 °С, но при охлаждении остается жидким вплоть до 45 °С. При приготовлении плотных сред его добавляют к водным растворам в концентрации 15-20 г/л, тогда как в полужидких средах его содержится не более 1 %. Разлагать агар в отличие от желатины способны лишь немногие бактерии. В тех случаях, когда требуются плотные среды, не содержащие органических компонентов, применяют силикагель.

3.2. Производственные основы питательных сред

В производстве питательных сред чаще всего используют животные или растительные основы различного природы. Наряду с мясными, среди наиболее распространенных следует выделить казеиновые, рыбные, дрожжевые, а также основы из кровяных сгустков и растительного происхождения.

Для получения основ, представляющих собой гидролизаты, при переваривании белков применяют ферменты животного, растительного или микробного происхождения, а также химический гидролиз. Процесс гидролиза белка имеет своей целью растворение и расщепление протеина с образованием азотистых соединений, усваиваемых микробной клеткой: пептонов, полипептидов, аминокислот, которые входят в состав получаемого таким образом гидролизата. Гидролиз называют перевариванием, если процесс осуществляется с помощью протеолитических ферментов. Гидролиз называют аутолизом, если белки перевариваются собственными ферментами. Из животных ферментов чаще всего используют поджелудочную железу крупного рогатого скота, свежую или консервированную, или сухие препараты из нее промышленного приготовления: панкреатин, трипсин. Выпускаемый сухой ферментативный препарат пепсин готовят из слизистой свиных желудков. В качестве растительных и микробных ферментов используют протеазы, выделяемые из бактерий. Путем аутолиза получают гидролизаты из дрожжей и рыбы. Гидролизаты, получаемые с помощью пепсина, называют пептонами, трипсина - триптонами. Пользуясь пепсином в виде свиных желудков, получают гидролизат с преобладанием пептонов над аминным азотом. Панкреатин глубоко расщепляет молекулу белка и позволяет получить гидролизаты с высокой концентрацией пептона и аминного азота. Грибная протеаза еще глубже расщепляет белки, в виде очищенного спиртом концентрированного препарата она по своему действию ближе к панкреатину. Переваривание относится к щадящим методам гидролиза, поэтому в гидролизате обычно полностью сохраняются аминокислоты и витамины.

К гидролитическому распаду белковой молекулы приводит автоклавирование под давлением любого белкового сырья в кислой (реже щелочной) среде (химический гидролиз). Получаемые таким образом гидролизаты (кислотные или щелочные) имеют черную или темно-коричневую окраску и поэтому требуют дополнительной обработки (например, осветление или другие операции). Процесс химического гидролиза в условиях высокой температуры сопровождается образованием продуктов карамелизации (аминосахаров и других соединений), угнетающих рост и развитие микроорганизмов, а также разрушением отдельных классов соединений, например, витаминов. В связи с этим гидролизаты очищают и осветляют активированным углем. Частичное разрушение витаминов и адсорбцию на угле восполняют внесением ростовых факторов и стимуляторов роста.

Таким образом, состав гидролизата и его качество зависят от аминокислотного состава белка, метода гидролиза, вида фермента, количества воды, соотношения и концентраций фермента и субстрата (или субстрата и кислоты), предварительной обработки сырья, рН, температуры, продолжительности гидролиза, условий перемешивания и ряда других не учитываемых факторов.

3.3. Стимуляторы и ингибиторы роста

Ускоряющие рост микроорганизмов факторы называют стимуляторами роста. Стимулирующее влияние оказывают, прежде всего, отдельные компоненты питательной среды. В таких случаях стимуляция происходит за счет более легкого усваивания такого компонента путем включения его в структуру белка или других соединений, являющихся составными частями ферментов, нуклеопептидов, пептидов и т. п.

Стимулирующее влияние могут оказывать поверхностно-активные вещества. Механизм стимуляции в этом случае заключается в том, что эти вещества в процессе культивирования не включаются в ферментную систему, а улучшают проницаемость клеточных мембран, увеличивают аэрацию культуральной жидкости и способствуют транспорту кислорода и субстрата к клеткам растущей культуры. Стимулирующим действием обладают вещества, снижающие окислительно-восстановительный потенциал среды (например, сульфит натрия).

В условиях периодического культивирования в начале экспоненциальной фазы развития популяции накапливаются стимулирующие метаболиты, тогда как ингибирующие соединения образуются преимущественно в период стационарной фазы роста и фазы постепенного отмирания микробов. Вместе с тем один и тот же компонент среды может стимулировать рост микроорганизмов в малых концентрациях и ингибировать при увеличении его содержания в среде. Необходимо помнить, что в некоторых случаях концентрация, лимитирующая недостатком, близка к ингибирующей избытком.

Ингибиторы подразделяются на специфические и неспецифические. Специфическое ингибирование связано с синтезом биомолекул, оказывающих отрицательное влияние на рост бактериальной культуры. Неспецифическое ингибирование обусловлено изменением физико-химических параметров питательной среды, например, величины рН. Для инактивации неспецифических ингибиторов бактериального роста в питательной среде используют определенные добавки.

3.4. Стерилизация питательных сред

Стерилизация питательных сред осуществляется главным образом путем автоклавирования. Однако используемые режимы стерилизации являются относительно щадящими и не обеспечивают полной гибели бактерий, в первую очередь устойчивых к температуре и, особенно, споровых форм микроорганизмов. Изменение режимов стерилизации путем повышения температуры и увеличения давления влекут за собой разрушение ряда питательных компонентов, что сказывается на качестве готовой продукции. Режимы стерилизации микробиологических питательных сред приведены в табл. 1.

Таблица 1. Стерилизация питательных сред

При дробной стерилизации от одного автоклавирования до другого среду сохраняют при комнатной температуре. Только в этих условиях сохранившиеся споры прорастают, но не успевают размножиться.

Стерилизация мелкой лабораторной посуды (пробирок, пипеток, чашек Петри, флаконов с ватно-марлевыми пробками) может быть проведена также в сухожаровых шкафах при температуре 160-180 °С в течение 1 часа.

Для контроля над температурой при стерилизации пользуются некоторыми веществами, плавящимися при определенной температуре и при этом окрашивающимися примешиваемыми к ним красками (0,01 г краски на 1 00 г вещества). С этой целью наиболее часто используют смесь бензойной кислоты с красками (118-122 °С), мочевину (132 °С) и др. Для контроля стерилизации эти вещества тщательно размельчают, смешивают и насыпают в стеклянные трубочки одного диаметра, которые запаивают. Испытания проводят для равномерности распределения температуры во многих местах автоклава. Для контроля стерилизации сухим жаром при температуре 185 °С тест-пробирки наполняют сахарозой и запаивают. Кроме того, для измерения температуры используют термографы.

3.5. Физико-химические показатели качества

Приготовленные питательные среды подлежат обязательному контролю. Для оценки качества сред по физико-химическим показателям могут быть использованы следующие параметры:

- прозрачность;

- цветность;

- влажность;

- плотность (для плотных сред);

- зольность;

- содержание общего и аминного азота (суммарного азота аминогрупп, аминокислот и низших пептидов;

- степень расщепления белка, выраженная в отношении аминного азота к общему (NН₂ / N);

- содержание белка, пептонов и пептидов (продуктов полураспада белковой молекулы), липидов, углеводов, хлоридов (изотоничность), анионов, металлов;

- аминокислотный состав;

- окислительно-восстановительный потенциал;

- рН;

- буферная емкость;

- витаминный состав.

Среди физико-химических показателей при определении качества питательных сред чаще всего определяют окислительно-восстановительный потенциал (ОВП), рН и некоторые другие.

Большинство микробов при своем росте восстанавливают среду, то есть ОВП снижается. При длительном хранении готовых питательных сред их ОВП увеличивается за счет образования окислительных соединений, поэтому рост большинства микробов на таких средах прекращается.

Определение рН можно проводить колориметрическим методом (при помощи шкалы Михаэлиса и компоратора Уолпола), когда в качестве индикатора рН среды в пределах 6,8-8,4 применяют 0,3 % водный раствор метанитрофенола (одного из индикаторов Кларка), однако чаще для этого используют потенциометрию, то есть электрохимический метод анализа.

На заключительном этапе при приготовлении питательных сред их качество контролируют на основе биологических показателей, при этом определяют: 1) чувствительность среды; 2) показатели прорастания; 3) скорость роста; 4) урожайность культуры и некоторые другие параметры. Результаты такой оценки позволяют говорить о соответствии той или иной серии среды общим медико-биологическим требованиям (ОМБТ) и о возможности ее использования в соответствии с целевым назначением.