ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ - В. А. Галынкин - 2015

ЧАСТЬ II. АНТИМИКРОБНЫЕ АГЕНТЫ

ГЛАВА 14. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

Избирательность действия антимикробных препаратов связана со структурными и метаболическими различиями клеток микро- и макроорганизма. Химиотерапевтический препарат действует на определенный участок системы метаболизма микробной клетки, который является его мишенью. Такими мишенями могут быть отдельные участки синтеза клеточной стенки, белка, нуклеиновых клеток и т. д.

14.1 Ингибиторы биосинтеза компонентов клеточной стенки

14.1.1 Биосинтез пептидогликана

Пептидогликан (муреин) является важнейшей структурой клеточной стенки бактерий, поэтому нарушение его биосинтеза некоторыми антибиотиками приводит к гибели микроорганизма или прекращению размножения клеток. Структура, подобная пептидогликану, отсутствует в клетках млекопитающих, что обеспечивает избирательность действия антибиотика. Молекула пептидогликана состоит из линейных цепей чередующихся единиц N-ацетилмурамовой кислоты и N-ацетилглюкозамина, связанных поперечными пептидными мостиками. Предшественники пептидогликана синтезируются в цитоплазме, собираются на молекуле липида-носителя, на цитоплазматической мембране и на первом этапе включаются в клеточную стенку, образуя цепи гликана без поперечных сшивок. На втором этапе эти цепи сшиваются с ранее образованным пептидогликаном с помощью фермента, локализованного на внешней стороне цитоплазматической мембраны. Эти этапы биосинтеза пептидогликана существуют у всех грамположительных и грамотрицательных бактерий, межвидовые различия могут касаться некоторых деталей, в частности, состава аминокислот в пептидных мостиках.

Подробно процесс изучен у Escherichia coli. Предшественники пептидогликана — N-ацетилглюкозамин и N-ацетилмурамилпентапептид синтезируются в цитоплазме, каждый из них связан с молекулой носителя — уридиндифосфата (УДФ), обеспечивающего энергией реакции синтеза. Пентапептид, соединенный с N-ацетилмурамовой кислотой, содержит L-аланин, D-глутаминовую кислоту, мезодиаминопимелиновую кислоту и два остатка D-аланина на С-конце пептида. Липидноситель — это высоколипофильный ундекапренилафосфат, который располагается в цитоплазматической мембране и действует как акцептор предшественников пептидогликана на ее внутренней поверхности. N-ацетилмурамилпентапептид и N-ацетилглюкозамин последовательно переходят от своего УДФ-носителя на липидноситель с освобождением уридинмонофосфата (УМФ) и УДФ, соответственно, и образованием β-1,4-гликозидной связи. Дисахаридпентапептид присоединяется к липидоносителю пирофосфатной связью. В этой форме он транслоцируется через цитоплазматическую мембрану и присоединяется к существующему пептидогликану клеточной стенки в зоне ее роста. Соответствующий генетический контроль обеспечивает сохранение характерной формы клетки за счет присоединения вновь синтезированных элементов в определенном локусе.

Предполагают, что линейный гликан, присоединенный к другой молекуле липидоносителя, служит в клеточной стенке местом связывания вновь транслоцированного дисахаридпентапептида. Линейный гликан соединяется с ним с образованием гликозидной связи между остатком N-ацетилмурамовой кислоты гликана и N-ацетилглюкозамина вновь транслоцированного дисахаридпентапептида. Реакция трансгликозилирования приводит к увеличению линейного гликана на одну дисахаридную единицу и освобождению липида-носителя в форме пирофосфата. Носитель утрачивает одну молекулу фосфата под действием пирофосфорилазы и возвращается в цикл транслокации дисахаридпентапептида из цитоплазмы к клеточной стенке.

В клеточной стенке происходит образование поперечной сшивки. Вновь синтезированный линейный гликан присоединяется к пептидогликану стенки путем образования пептидных связей. Эту функцию выполняют транспептидазы (ТПазы), расположенные на внешней части цитоплазматической мембраны. Вначале ТПазы связываются с остатком D-аланил- D-аланина пентапептида в линейном гликане. Пептидаза отщепляет терминальный D-аланин, а ТПаза соединяется с С-концом оставшегося D-аланина, образуя активный интермедиат. Следующая стадия реакции транспептидирования заключается в переносе ацильной группы терминального остатка D-аланина к акцепторной аминогруппе диаминопимелиновой кислоты ближайшей цепи пептидогликана. Новая пептидная связь образуется между карбоксильной группой D-аланина вновь синтезированной цепи гликана и аминогруппой диаминопимелиновой кислоты существующего пептидогликана, а ТПаза освобождается. Предполагается, что энергия, освобождающаяся при разрыве связи D-аланил-D-аланин используется для реакции образования пептидной сшивки.

Пептидогликан Е. coli и многих бацилл имеет лишь 20-30% поперечных сшивок. Однако все свободные пептиды, соединенные N-ацетилмурамовой кислотой, являются тетрапептидами, благодаря действию D, D-Карбоксипептидазы (КПазы), которая подобно ТПазе, отщепляет терминальный D-аланин без образования поперечной сшивки. Помимо этих ферментов в синтезе пептидогликана участвует эндопептидаза, которая расщепляет пептидные сшивки, возможно, создавая локусы для присоединения новых цепей пептидогликана; трансгликозилаза присоединяет к пептидогликану новые цепи гликана, которые затем сшиваются поперечными связями с помощью ТПазы.

14.1.2 Ингибиторы биосинтеза пептидогликана

Ингибиторами биосинтеза пептидогликана являются пенициллины, цефалоспорины и другие β-лактамы — цефокситин (цефамицин), латамоксеф (оксацефем), имипенем (карбапенем), азтреонам (монобактам), угнетающие образование поперечных связей. Такие антибиотики, как ванкомицин, тейхопланин и циклосерин, ингибируют другие стадии биосинтеза.

β-лактамы, являясь структурными аналогами β-аланил-β-аланина, конкурентно ингибируют ТПазы и КПазы путем образования ковалентных связей с активными центрами этих ферментов с расщеплением β-лактамной связи. Связь фермента с β лактамом значительно прочнее связи с его естественным субстратом. Кроме того, эти антибиотики активируют аутолитические ферменты, ответственные за удаление деградирующих компонентов клеточной стенки и разъединение дочерних клеток после деления.

Под действием ß-лактамов возникают морфологически измененные клетки и происходит их гибель. Эффект зависит от концентрации антибиотика.

Ванкомицин и тейхопланин имеют сродство к β-аланил-β-аланиновой части предшественников пептидогликана. Они связываются с этой областью и ингибируют перенос линейного гликана в клеточной стенке к дисахаридпентапептиду на его липидном носителе.

Таким образом, сборка пептидогликана останавливается до стадии транспептидирования. Из-за большой молекулярной массы эти антибиотики не проникают в клетки грамотрицательных бактерий и действуют только на грамположительные микроорганизмы.

Д-циклосерин действует на стадии образования β-аланил-β-аланина, ингибируя активность двух ферментов: аланин-рацемазы, которая конвертирует L-аланин в β-аланин, и синтетазу, которая образует дипептид. Циклосерин действует как конкурентный ингибитор этих ферментов, поскольку имеет структурное сходство с одной из возможных конформаций β-аланина.

Эхинокандины — новый класс антифунгальных антибиотиков, активных против Candida spp.; их полусинтетические аналоги действуют также на аспергиллы и Pneumocystis carinii,являясь неконкурентными ингибиторами (1,3)-p-β-глюкан синтазы — фермента, участвующего в синтезе глюкана — основного компонента клеточной стенки грибов.

14.2 Ингибиторы синтеза миколовых кислот и арабиногалактана у микобактерий

Клеточная стенка микобактерий содержит ковалентно связанные пептидогликан, арабиногалактан и миколовые кислоты (гидроксилированные жирные кислоты). Нековалентно связанные липидные компоненты представлены гликолипидами, фосфолипидами и восками. Липидные компоненты обеспечивают высокую устойчивость микобактерий к антимикробным агентам.

Изониазид в клетках микобактерий активируется системой ферментов каталаза-пероксидаза. В активированной форме он ингибирует дегидрогеназу, которая катализирует образование двойной связи при С₂₄ миколовой кислоты.

Этамбутол блокирует синтез арабиногалактана, ингибируя арабинозилтрансферазу — фермент, обеспечивающий перенос декапрениларабинозы при синтезе полисахарида.

14.3 Ингибиторы синтеза белка

Процессы синтеза белка у млекопитающих и бактерий во многом сходны, однако в них имеются некоторые различия, обеспечивающие избирательность действия многочисленных антибиотиков, антимикробная активность которых связана с подавлением синтеза белка. Многие антибиотики избирательно воздействуют на субъединицы рибосом прокариот (30 S или 50 S).

Аминогликозиды избирательно взаимодействуют с 30 S субъединицей рибосомы. Стрептомицин соединяется с одним из 21 белковых компонентов этой субъединицы, являющимся местом связывания фактора инициации IF-3, препятствуя началу синтеза белка. Стрептомицин также нарушает аминоацильный участок 30 S субъединицы, препятствуя размещению на нем аминоацил-тРНК. В результате происходит или угнетение синтеза белка, или неправильное считывание генетического кода.

Другие аминогликозиды также соединяются с 30 S субъединицей рибосомы в локусе близком, но не идентичном локусу связывания со стрептомицином, и угнетают синтез белка. Эффективность амино- гликозидов возрастает в результате их активного поглощения бактериальной клеткой. Процесс начинается с электростатического связывания антибиотика с отрицательно заряженной поверхностью клетки. При этом аминогликозиды повреждают внешнюю мембрану грамотрицательных бактерий, что сопровождается высвобождением некоторых липополисахаридов, белков и фосфолипидов. Далее происходит активный транспорт антибиотика через цитоплазматическую мембрану и его связывание с рибосомами. Анаэробные микроорганизмы не обладают системой активного транспорта аминогликозидов, поэтому резистентны к этой группе антибиотиков.

Тетрациклины связываются с 30 S субъединицей рибосомы и препятствуют связыванию аминоацил- тРНК с аминоацильным сайтом. 40 S субъединица рибосом млекопитающих также связывается с тетрациклинами, селективное действие этих антибиотиков основано на избирательный проницаемости. Бактерии активно поглощают тетрациклины, концентрация которых в цитоплазме может в 50 раз превышать концентрацию во внешней среде, тогда как у млекопитающих такая система активного транспорта отсутствует.

Хлорамфеникол избирательно угнетает синтез белка, связывая аминоацильный сайт 50 S субъединицы рибосомы и ингибируя ее пептидилтрансферазу. Этот фермент участвует в образовании новой пептидной связи между растущим пептидом в пептидильном сайте рибосомы и аминокислотой на аминоацил-тРНК в аминоацильном сайте. Хлорамфеникол проникает также и в клетки млекопитающих, но не связывается с 80 S рибосомами. Способность проникать в клетки обеспечивает эффективность его применения при лечении заболеваний, вызванных внутриклеточными паразитами, например, Salmonella typhi.

Эритромицин избирательно связывается с 50 S субъединицей рибосомы в сайте, близко расположенном к месту связывания хлорамфеникола, и угнетает процесс транслокации. Эритромицин не препятствует выходу пептидил-тРНК из аминоацильного сайта, но угнетает высвобождение тРНК из пептидильного сайта и препятствует перемещению туда пептидил-тРНК.

Линкомицин и клиндамицин связываются с 50 S субъединицей в области, близкой к области связывания хлорамфеникола и эритромицина, и блокируют элонгацию полипептидной цепи, ингибируя пептидил- трансферазу.

14.4 Препараты, нарушающие функции хромосомы

Репликация и транскрипция ДНК у бактерий принципиально не отличаются от этих процессов у млекопитающих, однако существуют и важные различия, на которых основана селективная активность некоторых антибактериальных препаратов.

Хинолоны (синтетические производные налидиксовой кислоты), например, норфлоксацин и ципрофлоксацин ингибируют ДНК-гиразу — фермент, уникальный для бактерий, и таким образом блокируют репликацию хромосомы, но не влияют на механизмы репликации ДНК, которые не зависят от гиразы.

Метронидазол и нитрофурантион. Предполагают, что действие этих веществ зависит от нестабильных метаболитов, которые образуются путем восстановления внутри бактериальной клетки. Эти неидентифицированные продукты вызывают разрыв цепи ДНК. Метронидазол обладает специфической активностью против анаэробных бактерий, у которых упомянутый метаболит образуется при низком уровне редокс-потенциала. Резистентность к метронидазолу не описана.

Рифампицин связывается с одним из белков, составляющих комплекс РНК-полимеразы, и блокирует действие этого фермента на стадии инициации транскрипции. Антибиотик не останавливает уже начавшийся процесс транскрипции. Резистентные штаммы появляются быстро в результате изменения строения молекулы РНК-полимеразы, которая более не связывает рифампицин.

Флуцитозин (5-фторцитозин) — это антифунгальный агент, наиболее активный против видов Candida, Cryptococcus, Torulopsis. Внутри клетки гриба флуцитозин деаминируется до 5-фторурацила, который угнетает синтез РНК; сам 5-фторурацил плохо проникает через клеточные барьеры. Candida albicans превращает флуцитозин в 5-фтордезоксиуридинмонофосфат, который угнетает синтез ДНК, ингибируя тимидилат- синтетазу.

14.5 Антагонисты фолатов

Существуют принципиальные различия в метаболизме фолатов у бактерий и млекопитающих. Бактерии не способны поглощать экзогенный фолат и должны синтезировать его сами. Процесс синтеза включает синтез дигидроптеровой кислоты из молекул птеридина и n-аминобензойной кислоты. Затем из дигидроптеровой и глутаминовой кислот образуется дигидрофолат (ДГФ). ДГФ восстанавливается дигидрофолатредуктазой с участием НАДФН₂ до тетрагидрофолата (ТГФ). ТГФ является переносчиком моноуглеродных радикалов (— СНО и — СН₃) в биосинтезе аденина, гуанина, тимина и метионина. Таким образом, нарушение синтеза ТГФ влияет на способность клетки синтезировать нуклеиновые кислоты и белки и угнетает ее рост. Клетки млекопитающих способны поглощать ДГФ из продуктов питания и превращать его в ТГФ с помощью дигидрофолатредуктазы (ДГФР). Сульфонамиды и триметоприм селективно угнетают метаболизм фолатов у бактерий. Первые ингибируют синтез дигидроптеровой кислоты, который не происходит у млекопитающих; второй обладает селективным сродством к бактериальной ДГФР. Оба эти вещества активны только в отсутствие в питательной среди аденина, гуанина, тимина и метионина.

Сульфонамиды, являясь структурными аналогами п-аминобензойной кислоты, конкурентно ингибируют ее включение в реакцию образования ДГФ.

Триметоприм — аналог ДГФ ингибирует дигидрофолатредуктазу; бактериальный фермент в несколько тысяч раз более чувствителен к нему, чем фермент млекопитающих, поэтому триметоприм не токсичен в дозах, применяемых при лечении микробных инфекций. Часто триметоприм используют в комбинации с сульфонамидами, обычно с сульфаметоксазолом в форме котримоксазола. Обе стадии, нарушающие метаболизм фолатов, синергидны, таким образом, сочетанное применение препаратов высокоэффективно, однако не предупреждает появление резистентных форм микроорганизмов.

14.6 Антимикробные агенты, воздействующие на цитоплазматическую мембрану

14.6.1 Мембраны бактерий

Мембраны бактерий существенно отличаются от мембран клеток грибов и млекопитающих: бактериальные мембраны не содержат стеролов, мембраны грибов содержат преимущественно эргостерол, а млекопитающих — холестерол. Но в основном мембраны клеток про- и эукариот имеют сходную структуру. У бактерий двойной слой фосфолипидов (фосфатидилэтаноламин, фосфатидилглицерол, дифосфатидил- глицерол) составляет 20-30% массы мембраны. Протеины (50-70% массы) располагаются по обе стороны мембраны и проникают сквозь слой липидов. Протеины и фосфолипиды соединены ионными, гидрофобными и водородными связями.

Большинство мембраноактивных агентов (спирты, фенолы, четвертичные аммониевые соединения, бисбигуаниды) повреждают целостность мембраны, нарушая ее метаболические функции и вызывая утечку содержимого цитоплазмы. Действие этих веществ слабо селективно, т. е. подобный эффект они производят и в отношении мембраны млекопитающих. Поэтому они используются в основном не как терапевтические средства, а как дезинфектанты, антисептики и консерванты. Полимиксин — один из мембраноактивных агентов, который может быть использован как терапевтическое средство против инфекций, вызванных Pseudomonas spp., однако токсичность этого препарата ограничивает его применение. Полиены и имидазолы являются важными антифунгальными средствами. Их селективное действие основано на тонких различиях в составе и биосинтезе мембран грибов и млекопитающих.

14.6.2 Полиены

Полиены, из которых наибольшее значение имеют амфотерицин В и нистатин, обладают сильным сродством к эргостеролу, что обеспечивает их селективное действие на клетки грибов. Гидрофобная область полиена связывается со стеролами мембраны, в результате чего гидроксилированная гидрофильная часть молекулы антибиотика втягивается внутрь мембраны. Таким образом в мембране возникают каналы, через которые цитоплазматическое содержимое (ионы К⁺, аминокислоты, нуклеотиды) выходит из клетки. Поскольку резко снижается pH цитоплазмы, макромолекулы разрушаются, и клетка погибает. Сродство полиентов к холестеролу ниже, чем к эргостеролу, поэтому клетки млекопитающих повреждаются меньше, однако при внутривенном введении амфотерицина В при лечении системных инфекций страдают почки.

14.6.3 Имидазолы

Имидазолы, из которых наиболее широко применяются миконазол и кетоконазол, имеют широкий спектр активности и действуют на дерматофиты, диморфные грибы, дрожжи, а также на грамположительные бактерии, хотя не используются при лечении бактериальных инфекций. Механизм их действия определяется повреждением мембран при связывании имидазолов с ненасыщенными жирными кислотами, присутствующими в фосфолипидах мембран. Кроме того, имидазолы угнетают биосинтез эргостерола, в частности, деметилирование 14-а-метильного радикала ланостерола, что сопровождается накоплением ланостерола, оказывающего токсичное действие на клетку. Угнетается также синтез триглицеридов и фосфолипидов. Наконец, кетокопазол ингибирует транспорт электронов в дыхательной цепи грибов в аэробных условиях за счет угнетения сукцинат- и НАДН- оксидаз. Важность последнего эффекта подтверждается значительно более низкой ингибирующей концентрацией препарата в аэробных условиях по сравнению с анаэробными.

Производные аллиламина (батрафен, ламизил) ингибируют скваленэпоксидазу в клеточной мембране гриба, в результате подавляется биосинтез эргостерола

на раннем этапе, эффективны в отношении дерматофитов, Candida spp.

14.6.4 Катионные пептиды

Катионные пептиды характеризуются высоким содержанием основных и гидрофобных аминокислот, поэтому их молекула амфипатична, т. е. обладает положительно заряженной гидрофильной и гидрофобной областями. Они взаимодействуют с цитоплазматической мембраной за счет электростатических сил, проникают в ее липидный слой и вызывают ее перестройку с образованием каналов, нарушающих проницаемость мембраны. Избирательность действия зависит от липидного состава мембран микроорганизмов и млекопитающих. Катионные пептиды могут также воздействовать на внешнюю мембрану грамотрицательных бактерий, конкурентно замещая в ней ионы Са²⁺ и Mg²⁺, что приводит к нарушению ее структуры, а также ковалентно связывать сульфгидрильные группы белков клеточной оболочки.