Молекулярная биология. Практическое руководство - Великов В.А. 2013

Выделение плазмидной и фаговой ДНК
Выделение плазмидной ДНК в больших объёмах (максипреп)

Метод предназначен для получения значительных количеств плазмидной ДНК высокого качества. Это бывает необходимо при продолжительной масштабной работе с определёнными векторами, рекомбинантными конструкциями или клонированными генами. Приведённый ниже метод также представляет собой модификацию метода шелочного лизиса бактериальных клеток. В определённом смысле процедура выделения ДНК сводится к пропорциональному увеличению количества исходного материала и объёмов реагирующих растворов.

В данной работе предполагается получить в значительных количествах ценную векторную ДНК. Фагмида pBluescript II KS+ - это вектор компании StratagemТМ, используемый для клонирования, секвенирования и экспрессии. Кроме того, эта фагмида (от слов фаг + плазмида) в отличие от обычных плазмид способна «упаковываться» в фаговые частицы в присутствии в клетке фага-помощника, поскольку она имеет ori фага М13, а фаговые белки для сборки вирионов поставляет хелпер. Вектор pBluescript II характеризуется более высоким числом копий на клетку чем плазмида pBR322 (см. прил. 1, 5).

Материалы и оборудование

Центрифуга для больших объёмов, весы, штамм кишечной палочки E.coli XL1-Blue, содержащий фагмиду pBluescript II KS+.

Растворы

- Раствор I (работа 4.1).

- Раствор II (работа 4.1).

- 10 М ацетат аммония. Растворить 770 г в 800 мл воды, довести до 1 л.

- Ампициллин (работа 4.1).

Методика

1. Вырастить ночную культуру бактерий при 37°С в 100-500 мл богатой питательной среды 2YT, содержащей 100 мкг/мл ампициллина в течение 20-24 ч при скорости роторной качалки-шейкера 200-300 об/мин.

2. Центрифугировать при 4000 об/мин 10-15 мин при 4°С, слить среду.

3. Центрифугировать при 4000 об/мин в течение 1 мин, отобрать микропипеткой остатки жидкости.

4. Ресуспензировать осаждённые клетки в 10 (или 5) мл раствора I.

5. Добавить 1 мл (или 0,5) свежеприготовленного раствора I c лизоцимом. Оставить на столе на 15 мин. (Клетки E.coli лизируются и без лизоцима).

6. Добавить 20 (или 10) мл раствора II, сразу интенсивно перемешать. Оставить на льду при 0°С на 5 мин.

7. Добавить 10 (или 5) мл холодного 10М ацетата аммония а (добавлять микропипеткой по каплям), смешать. Оставить при 0°С на 5 мин.

8. Центрифугировать при 5000 об/мин в течение 10 мин при +4°С.

9. Супернатант отобрать микропипеткой, разделить на две центрифужные пробирки, добавить к каждой по 12,5 мл изопропанола. Делать это нужно на весах. Оставить на столе на 10 мин для высаживания ДНК.

10. Центрифугировать при 5000 об/мин, 4°С, 10 мин, отбросить супернатант.

11. Центрифугировать при комнатной температуре 3 мин, отобрать остатки жидкости. Осадок плазмидной ДНК не подсушивать!

12. Растворить осадок в каждой микроцентрифужной пробирке в 400 мкл 2M ацетата аммония, объединить в одной 1,7 мл пробирке. Оставить при комнатной температуре на 5 мин (осаждение полисахаридов, белков).

13. Центрифугировать при комнатной температуре 10 мин.

14. Супернатант перенести в пробирку с равным объёмом (800 мкл) изопропанола б. Оставить на столе на 10 мин.

15. Центрифугировать при комнатной температуре 5 мин.

16. Сполоснуть осадок 70% этанолом.

17. Растворить плазмидную ДНК в 0,2-1 мл H2O. Для электрофореза достаточно взять 5-10 мкл раствора в.

Примечания

а Использование ацетата аммония вместо ацетата калия в качестве раствора III позволяет существенно уменьшить объёмы при центрифугировании. Кроме того, в присутствии ацетата аммония осаждаются полисахариды из раствора, а также белки (см. п.12). Это позволяет исключить из протокола работу с фенолом.

б Использование изопропанола для высаживания ДНК из раствора позволяет уменьшить объёмы. При масштабных работах важно минимизировать расход реагентов. Обычно используют равный объём изопропанола (минимум 0,6 V, для этанола — 2 V).

в Подвижность плазмидных форм для небольших плазмид приведена в прил. 9. Сначала идёт суперспиральная форма, при очень высоких концентрациях перед ней можно увидеть сверхсуперспираль. Затем движется линейная (встречается в старых препаратах или при нарушении протоколов) и потом релаксированная форма плазмиды (кольцевая двухцепочечная с разрывом в одной цепи). Это три основные формы. Выше над этими формами в концентрированных препаратах можно видеть димерную суперспиральную форму. Ещё выше по направлению к лунке иногда видны остатки хромосомной ДНК. При рестрикции все формы переводятся в одну полосу, соответствующую линейной форме (остатки хромосомы штамма-хозяина дают шлейф из фрагментов, чаще всего невидимый).