Молекулярная биология. Практическое руководство - Великов В.А. 2013

Выделение плазмидной и фаговой ДНК
Выделение репликативной формы RF фага М13

Бактериофаги (фаги) - вирусы бактерий; размножаются внутри клеток, что вызывает обычно их лизис. С химической точки зрения представляют нуклеопротеидные комплексы: фаг состоит из белковой оболочки (капсида), покрывающей одно- или двухцепочечную молекулу ДНК, или, реже, РНК.

Близкородственные нитевидные фаги М13, fl, fd и др. с вирионами, содержащими одноцепочечную ДНК относятся к умеренным - они не лизируют клетки, на которых размножаются (паразитируют). Векторы на основе нитевидных фагов удобны для секвенирования, поскольку из фаговых частиц можно выделить одноцепочечную ДНК +-цепей. Интерес к этим фагам обусловлен ещё и тем, что они составляют основу метода фагового дисплея - одного из основных аффинных методов белковой инженерии для изучения белок-белковых взаимодействий наряду с дрожжевыми двугибридными системами и белковыми микрочипами. Клонирование генов осуществляют в двухцепочечную ДНК нитевидного фага, существующую внутри клеток инфицированной популяции бактерий как плазмида. Если при клонировании «сшить» какой-либо ген c фаговым геном III (или VIII), кодирующем белок капсида gp3 (gp8), то полученный при трансляции гибридный белок будет презентирован на поверхности зрелого вириона в виде фьюжен-конструкта (англ. fusion - слияние, сплав). Такой фаг, а равно и библиотека генов в векторе М13 называется «фаг-дисплей», поскольку это дисплей пептидов на поверхности фаговых частиц (McCafferty et al., 1990).

Выделение двухцепочечной кольцевой репликативной (RF) формы фага М13 из клеток E.coli может быть проведено по любому из методов, используемых при выделении плазмид. Фаг М13 инфицирует только F+ штаммы кишечной палочки, поскольку сорбируется на F-пилях.

Приведена методика заражения (трансфекции) клеток E.coli фагом М13 c последующей наработкой RF-формы для получения двухцепочечной ДНК.

Материалы и оборудование

F+ штамм кишечной палочки E.coli XLl-Blue (TG-1, JS5 или другой), фаг M13 K07 в буфере ТЕ с титром 10 частиц /мл, центрифуга, шейкер.

Растворы

- Раствор I (работа 4.1)

- Раствор II (работа 4.1)

- 10 М ацетат аммония. Растворить 770 г в 800 мл воды и довести до 1 л.

- Канамицин. Раствор 100 мг/мл в воде.

Методика

1. Вырастить культуру клеток F+ штамма E.coli в 5 мл жидкой среды 2YT в течение ночи. Число клеток при этом может достичь 10¹⁰ клеток/мл.

2. Заразить культуру фагом в соотношении 10:1 (на 1 бактериальную клетку должно приходиться порядка 10 фаговых частиц). Для этого необходимо в пробирку к клеткам добавить 10 мкл суспензии фаговых частиц.

3. Инкубировать без качания 1 ч при 37°С. За это время фаг М13 К07 сорбируется на F-пилях, проникнет в клетку и начнётся синтез его RF. Эффективнось трансфекции E.coli выше трансформации (тема 8).

4. Добавить в 500 мл свежей среды 2YT необходимый антибиотик ^а (500 мкл раствора канамицина с концентрацией 100 мг/мл), перелить туда заражённые фагом клетки E.coli.

5. Растить культуру с аэрацией в течение ночи при 37°С.

6. Клетки осадить центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10-15 мин. Слить супернатант с культуральной средой в чистую колбу ^б.

7. Выделить из осаждённых клеток двухцепочечную кольцевую ДНК репликативной формы фага по протоколу минипреп (работа 4.1).

Примечания

^а Фаг M13 K07 (Viera, Messing, 1987) является рекомбинантным и имеет ген канамицин-устойчивости (см. прил. 1). Фаг М13 «дикого типа» растят без антибиотика.

^б В культуральной жидкости содержатся вышедшие из клеток фаговые частицы. Их легко можно выделить, как описано в работе 4.4, пропорционально увеличив при этом объёмы. Титр фаговых частиц определяют путём трансфекции клеток E.coli и последующего рассева клеток на агаризованную питательную среду с антибиотиком.