Молекулярная биология. Практическое руководство - Великов В.А. 2013

Выделение плазмидной и фаговой ДНК
Выделение одноцепочечной ДНК фага М13

Вышедшие из инфицированных клеток E.coli в культуральную среду фаговые частицы (вирионы) сравнительно просто можно выделить. Сначала клетки отделяют центрифугированием, а фаговые (а также фагмидные) частицы высаживают из культуральной среды полиэтиленгликолем (PEG).

Линейная молекула одноцепочечной ДНК каждого вириона заключена в белковый капсид. Размер ДНК фага «дикого типа» составляет 6407 нукл. Капсид включает примерно 2700 молекул белка gp8 и по несколько молекул белков gp3, gp6, gp7 и gp9, присоединяющихся к +-цепи ДНК в процессе самосборки фаговой частицы. Размеры частиц - 895 нм в длину и 6 нм в толщину. Белки можно денатурировать и затем удалить, используя фенол или другие хаотропные агенты, разрущающие третичную структуру макромолекул, а высвободившуюся ДНК высадить из раствора этанолом. Выход ДНК фага из культуральной среды объемом 1,5 мл из-под инфицированной культуры E.coli достаточен для фореза и секвенирования.

Материалы и оборудование

Инфицированная фагом M13 K07 культура E.coli, шейкер.

Растворы

- Раствор PEG/NaCl. Водный раствор 20% PEG-6000; 2,5M NaCl.

- Смесь фенол-хлороформ (работа 1.1).

- Смесь хлороформ-изоамиловый спирт (работа 1.1).

Методика

1. Перенести 10 мкл инфицированных фагом клеток кишечной палочки из культуры, находящейся в логарифмической фазе роста в жидкой питательной среде, в 2,5 мл питательной среды 2YT с антибиотиком а. Можно также взять одну колонию петлёй со свежей чашки с 2YТ-агаром.

2. Инкубировать культуру на качалке-шейкере при скорости 200-300 об/мин и температуре 37°С в течение ночи с хорошим аэрированием.

3. Отобрать 1,5 мл культуры и поместить в 1,7 мл пробирку типа Eppendorf.

4. Осадить клетки центрифугированием в течение 5-10 минут.

5. Отобрать супернатант в чистую пробирку и добавить 1/10 объёма PEG/NaCl (150 мкл) для осаждения фагов. Оставить при 0°С на 15 мин.

6. Центрифугировать 5 мин на максимальной скорости микроцентрифуги.

7. Удалить супернатант микропипеткой.

8. Ресуспензировать осадок фаговых частиц в 400 мкл буфера TE б.

9. Добавить равный объём смеси фенол-хлороформ, хорошо перемешать встряхиванием и центрифугировать в течение 5 мин. Происходит экстракция ДНК из ДНП-комплекса. ДНК находится в верхней водной фазе, фенол внизу, а в интерфазе - денатурированные белки.

10. Отобрать около 300-350 мкл верхней водной фазы стараясь не захватывать интерфазу в чистую пробирку.

11. Добавить равный объём смеси хлороформ-изоамиловый спирт, встряхнуть и центрифугировать 5 мин. Происходит разделение фаз, остатки фенола растворяются в нижней органической фазе.

12. Отобрать около 250-300 мкл водной фазы в чистую пробирку.

13. Добавить 1 мл 96% этанола и центрифугировать 10 мин, 13000 об/мин.

14. Удалить супернатант, промыть осадок. Растворить ДНК в 10 мкл H2O.

Примечания

а Обязательно должна присутствовать селекция против незараженных бактерий. Фаги семейства М13 в отличие от фага лямбда не лизируют заражённые ими клетки. Они реплицируются, упаковываются в вирионы и выходят из клеток, не мешая им делиться; лишь размножаются инфицированные бактерии процентов на 30-40 медленнее. Однако, метаболическая нагрузка на бактериальную клетку столь велика, что если какая-то клетка окажется незараженной, то она обгонит инфицированных в росте и размножении.

б На этом этапе можно прерваться, убрав препарат в холодильник. На следующий день провести очистку ДНК от компонентов белкового капсида, денатурировав протеины фенолом, разрушающим третичную структуру макромолекулы (переход - глобула-цепь).