Молекулярная биология. Практическое руководство - Великов В.А. 2013

ПЦР

ПЦР, полимеразная цепная реакция - это ферментативное копирование определенного фрагмента ДНК in vitro c помощью ДНК-полимеразы, т.е. селективная амплификация ДНК. Границы фрагмента задают нуклеотидными последовательностями праймеров, поэтому копированию подвергается только определённый ген (ДНК-мишень), а не вся ДНК как при репликации in vivo. Основоположником метода считается Кэрри Муллис (Mullis, 1985).

ПЦР включает три циклически повторяющиеся стадии (см. прил. 15):

1) денатурацию ДНК - расплетение двойной спирали и расхождение полинуклеотидных цепей;

2) отжиг праймеров - гибридизацию праймеров и одноцепочечной ДНК-мишени с образованием двухцепочечных комплексов «праймерматрица», необходимых для инициации синтеза ДНК из мономеров - дезоксирибонуклеозидтрифосфатов;

3) полимеризацию - достраивание (удлинение, элонгацию) комплементарных цепей ДНК ферментом ДНК-полимеразой в направлении 5’→3’ начиная от 3’-OH концов присоединённых праймеров. Т.е. матричный синтез ДНК (нем. matrize, от латинского matrix - матка, источник, начало).

Многократное (циклическое) повторение этих трёх стадий приводит к экспоненциальному обогащению реакционной смеси молекулами ДНК- мишени, поскольку в каждом новом цикле в качестве матрицы выступает не только исходная ДНК, но и вся ДНК, синтезированная в предыдущих циклах. Поэтому реакция относится к цепным. Теоретически за N циклов может получиться 2N молекул ДНК-мишени. Протекание ПЦР, т.е. переход от стадии к стадии и от цикла к циклу, регулируется изменением температуры.

Температура денатурации ДНК. Для любой высокомолекулярной геномной ДНК обычно задают 95°С. Для продуктов амплификации, а тем более комплексов «праймер-матрица» эта температура ниже.

Температура отжига праймера - температура, при которой возможно связывание праймерного олигонуклеотида с одноцепочечной ДНК-матрицей при охлаждении реакционной смеси, следующем за стадией денатурации. Для каждого конкретного праймера она рассчитывается отдельно и лежит в пределах 50-65°С. Это вариабельная температура.

Температура элонгации зависит от типа используемого фермента. Для ферментативной активности ДНК-полимеразы Taq из термофильной бактерии Thermus aquaticus температурный оптимум составляет 72°С.

Коммерческие фирмы продают наборы реагентов для проведения ПЦР, где все компоненты реакции, за исключением праймеров и матрицы, уже смешаны в нужных концентрациях (см. работу 6.2) и расфасованы в тонкостенные пробирки. В том числе добавлен и фермент, индуцируемый нагревом и потому неактивный. Задача исследователя состоит в том, чтобы добавить в пробирку ДНК-матрицу и специфичные праймеры в нужном количестве, поставить пробирки в амплификатор и задать нужный режим.