Молекулярная биология. Практическое руководство - Великов В.А. 2013
ПЦР
Подбор праймеров
Праймеры - синтетические олигонуклеотиды, состоящие из 16-30 оснований. Они комплементарны участкам ДНК, между которыми находится последовательность-мишень. Праймер (англ. primer) является обязательным компонентом («затравка»), необходимым для работы ДНК-полимеразы: к его 3’-ОН концу фермент присоединяет нуклеотиды, комплементарные матрице.
Праймер к 5’-концу гена называют прямым (forward, For), к 3’-концу гена - обратным или встречным (reverse, Rev). В базах данных нуклеотидных последовательностей приведена только одна цепь ДНК - значащая, та, что транскрибируется в виде мРНК. По ней подбирают прямой праймер, т.е. тот праймер, от которого будет расти именно эта цепь. Обратный праймер подбирают для комплементарной цепи, но также в направлении 5’→3’.
В приведённой ниже работе требуется «вручную», без использования специальных программ подобрать праймеры для амплификации гена НАДН-дегидрогеназы гадюки Никольского (Vipera nikolskii) и составить режим ПЦР.
Ход работы
1. Найдите информацию о первичной структуре гена НАДН-дегидрогеназы гадюки обыкновенной, по которой можно подобрать праймеры для ПЦР- амплификации этого гена у других видов гадюк. Для этого откройте сайт US National Library of Medicine, базу GenBank (http://www.pubmed.com).
2. Введите латинское название организма и интересующий ген (Vipera berus NADH dehydrogenase).
3. Выберите вкладку «Nucleotide» и нажмите «Enter».
4. Скопируйте информацию в файл. Один из сиквенсов (англ. sequence - последовательность) для примера приведён на рис. 1.
5. Подберите праймеры для ПЦР, прямой и обратный. Для прямого праймера достаточно выбрать короткий отрезок гена вблизи его 5’-конца с оптимальной длиной около 20 нуклеотидов. Для подбора обратного праймера нужно восстанавливать комплементарную цепь ДНК. Любую нуклеотидную последовательность записывают в направлении 5’→3’ a.
6. Расчитайте температуру отжига ваших праймеров и составьте режим ПЦР.
Рис.1. Ген НАДН-дегидрогеназы гадюки обыкновенной V.berus
Правила подбора праймеров
- Размер праймера должен составлять 16-25(30) нуклеотидов.
- CG-состав должен лежать в пределах 50-60 %.
- Разница в температуре отжига обоих праймеров - не более 6°С.
- Праймеры не должны быть само- и взаимно-комплементарными.
- Нуклеотиды 3’-конца праймера должны быть строго комплементарны матрице (замены возможны на 5’-конце длинных праймеров б).
Расчёт температуры отжига праймера
Для точного расчёта оптимальной температуры существует множество программ и алгоритмов. Упрощенный расчёт можно провести по формулам:
Примечания
а Не забывайте об антипараллельности цепей ДНК при подборе обратного праймера. Если он будет иметь нужный состав, но другую полярность ПЦР-продукт получен не будет. Такой праймер (параллельный) не будет отжигаться на матрицу, т.е. образование гибридного комплекса олиго-/полинуклеотид невозможно.
Олигонуклеотид любого состава может быть по заказу синтезирован специализированной фирмой. По желанию заказчика в его состав введут флуоресцентную метку. На его 5’-конец при заказе можно добавить какие-либо нуклеотиды, к примеру, нуклеотиды сайта узнавания определённой рестриктазы. Компания примет заказ и на сиквенс полученного ПЦР-продукта: праймер для его секвенирования уже есть в наличии.