Молекулярная биология. Практическое руководство - Великов В.А. 2013

Трансформация бактерий
Электропорация E.coli

В специальную кювету с зазором между электродами 1-2 мм добавляют «электрокомпетентные клетки» и очищенную плазмидную ДНК, пропускают высоковольтный импульс и сразу же добавляют к клеткам порцию жидкой питальной среды. Затем клетки рассеивают шпателем на питательный агар с антибиотиком и инкубируют сутки до появления хорошо видимых колоний.

Компетентные Са²⁺-клетки E.coli можно трансформировать неочищенной лигазной смесью и вообще любой ДНК, находящейся в умеренносолевом буфере. В случае электрокомпетентных клеток ДНК должна быть очищена, поскольку высокая концентрация соли способна вызвать искровой разряд в ячейке электропоратора.

Напряжённость электрического поля, продолжительность его действия, концентрация ДНК и плотность суспензии реципиентных клеток для каждой клеточной культуры, отличной от E.coli, подбирают экспериментально, с тем, чтобы достичь высокого процента поглощения ДНК клетками и их выживания после «электропробоя» биомембран.

Поскольку электропоратор является высокоспециализированным прибором, то к нему прилагаются детальные инструкции по проведению трансформации клеток разного типа (производители Bio-Rad, Eppendorf).

Материалы и оборудование

Электропоратор, кюветы для электропоратора (с зазором 2 мм), «электрокомпетентные клетки» E.coli XL1-Blue, раствор ДНК фагмиды pBluescript II SK+ (0,5 мкг/мл) или лигазная смесь.

Методика

1. Кювету заранее охладить во льду или в холодильнике в течение 5-10 мин.

2. Оттаять необходимое количество клеток во льду. Встряхнуть.

3. Перенести аликвоту ДНК ^а в количестве 10 пг (2 мкл раствора 0,5 мкг/мл, разведённого в 100 раз) в пробирку и затем добавить 50 мкл компетентных клеток. Можно, наоборот, к клеткам прибавить ДНК и осторожно смешать.

4. Смешать наконечником, не пипетировать.

5. Перенести кювету в ячейку электропоратора.

6. Установить параметры электропорации: 2,5 кВ при зазоре кюветы 2 мм.

7. Провести импульс, нажав соответствующую кнопку. Обычно получается время импульса порядка 5 мс, значение обязательно нужно проверить.

8. Добавить в кювету 1 мл среды SOC (работа 8.2) и пипетировать 2-3 раза.

9. Перенести электропорированные клетки в пробирку, инкубировать в течение 0,5-1 ч при 37°С ⁶ с аэрацией при качании на шейкере.

10. Высеять аликвоту 50-100 мкл на 2YT-агар с нужным антибиотиком.

Примечания

^а От солей в препарате ДНК можно избавиться микродиализом. Или переосадить ДНК и хорошо промыть осадок. Самый простой способ защититься от попадания лигазы в клетки при трансформации лигазной смесью - инактивировать её нагревом.

^б Это время необходимо для возобновления биохимических процессов в клетке и начала транскрипции генов устойчивости к антибиотикам и сопряжённой трансляции.