Молекулярная биология. Практическое руководство - Великов В.А. 2013

Выделение рекомбинантного белка
Индуцированная экспрессия клонированных генов

Гены клонируют либо с собственными регуляторными элементами (промоторами, терминаторами и др.) в векторах для клонирования, либо структурную часть гена подстраивают генно-инженерными методами под какой-либо регулируемый промотор в векторах для экспрессии. В этом случае экспрессию гена сравнительно легко регулировать. В норме он, как правило, репрессирован. Наработка рекомбинантного белка начинается лишь после добавления определённого индуктора в питательную среду для культивирования клеток-продуцентов. Очень часто в векторах для экспрессии используют промотор LacZ гена ß-галактозидазы E.coli (см. прил. 6). Индуктором экспрессии белка с этого промотора является лактоза или негидролизуемый аналог лактозы - изопропил-ß-D-тиогалактозид (ИПТГ). Добавление глюкозы в среду репрессирует биосинтез белка.

Некоторые векторные системы, использующие для транскрипции клонированного гена не аппарат клетки-хозяина, а весьма процессивные РНК- полимеразы бактериофагов, также индуцируются с помощью ИПТГ. Так, в штамме E.coli BL21(DE3) индуцируемый ген РНК-полимеразы фага Т7 (рекомбинантный, с промотором LacZ-типа) находится в хромосоме клетки- хозяина, а целевой ген под промотором фага Т7 находится на какой-либо плазмиде серии pET (NovageneЕТМ прил. 1, 2). В таких системах полностью отсутствует «фоновая» экспрессия, поскольку транскрипция и сопряжённая с ней трансляция клонированного гена возможны только после индуцированного синтеза фаговой РНК-полимеразы. Клонирование гена в плазмиды pET30a, pET30b и pET30c обеспечит гарантированное попадание вставки ДНК в нужную рамку чтения, поскольку эти плазмиды отличаются инсерцией 0, 1 или 2 нуклеотидов за промотором фага Т7.

В работах 9.1—9.3 приведены протоколы методов для индуцирования синтеза рекомбинантного белка в клетках E.coli c промотора LacZ, выделения белка из периплазмы бактериальных клеток и его очистки диализом.

Работа 9.1. Индуцированная экспрессия клонированных генов

Для получения целевого белка клетки клонов-продуцентов размножают, помещая их в свежую питательную среду. Среда должна содержать селективный антибиотик, иначе бактерии могут потерять рекомбинантную плазмиду. Наработка рекомбинантного белка начинается лишь после добавления индуктора. По мере роста бактериальной культуры возрастает суммарное количество целевого белка за счёт активной транскрипции- трансляции клонированного гена и увеличения числа клеток в популяции. Оно достигает насыщения в позднелогарифмической фазе роста культуры.

Приведена методика индукции синтеза миниантител определённой специфичности клетками клона-суперпродуцента. Миниантитела scFv - это рекомбинантные белки, состоящие из ковалентно сшитых вариабельных доменов легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов (scFv - single chain Fragments variable). Клон-суперпродуцент - это клон штамма E.coli JS5, содержащий рекомбинантную фагмиду pHENl с геном миниантитела, специфичного к белку вирулентности VirE2 почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens (Великов с соавт., Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 2006, №1). Рекомбинантные ScFv нужной специфичности получают технологией фаг-дисплея - Antibody Phage Display.

С помощью приведённой методики можно работать с любой другой рекомбинантной конструкцией, имеющей промотор гена LacZ.

Оборудование и материалы

Штамм E.coli JS5, содержащий фагмиду pHEN1 с геном миниантитела scFv, центрифуга, шейкер.

Растворы

- Среда 2YT (тема 1).

- Ампициллин. Раствор 100 мг/мл в воде.

- 40% глюкоза.

- 1М ИПТГ. Раствор 154 мг/мл в воде.

- 50мМ NaCl.

Методика

1. Посеять клетки штамма E.coli JS5 (pHEN1::scFv), содержащие фагмиду с клонированным геном миниантитела в 10 мл среды 2YT. Среда должна содержать 100 мкг/мл антибиотика ампициллина и 1 % глюкозы. Для этого в пробирку с культурой добавить 10 мкл стокового раствора ампициллина и 250 мкл 40% глюкозы. Наращивать в течение ночи с аэрацией при 37°С.

2. Ночную культуру развести в 100 раз той же средой (вылить 10 мл в колбу с 1 л среды) и растить при 25°С до оптической плотности 0,5 при 600 нм.

3. Клетки осадить в центрифуге при 4000 об/мин в течение 10 мин.

4. Ресуспензировать клетки в 50 мл 50мМ раствора NaCl для отмывки от глюкозы.

5. Снова осадить клетки при 4000 об/мин в течение 10 мин.

6. Добавить к отмытым клеткам индуктор. Для этого ресуспензировать осадок клеток сначала в малом объёме, а затем в 1 л среды 2YT, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 1мМ ИПТГ. Для получения необходимых конечных концентраций добавить в 1-литровую колбу 1000 мкл стокового раствора антибиотика и 1000 мкл стокового раствора индуктора ИПТГ.

7. Клетки инкубировать в течение 3 ч при 25°С на шейкере. При пониженной по сравнению с 37°С температуре накопление рекомбинантного белка идёт лучше и не бывает самолизиса культуры при суперпродукции.

8. Остановить рост бактериальной культуры, поставив колбу в холодильник на +4°С, после чего выделить рекомбинантные миниантитела.