Молекулярная биология. Практическое руководство - Великов В.А. 2013

Определение концентрации белка
Концентрирование белков путем осаждения ТХУ

Метод осаждения белков трихлоруксусной кислотой полезен, когда концентрация белка в коллоидном растворе слишком мала для анализа или объём раствора слишком велик, чтобы нанести нужное количество белка в лунку геля при электрофорезе. Осадок растворяют в меньшем объёме буфера, концентрируя, таким образом, раствор белка.

Материалы и оборудование

ТХУ, дезоксихолат натрия, раствор белка БСА, раствор исследуемого белка, центрифуга.

Растворы

- Трихлоруксусная кислота (ТХУ).

- 0,15% дезоксихолат натрия. Хранить при комнатной температуре.

Методика

1. Если минимальная концентрация белка порядка 5 мкг/мл, то к раствору белка добавить 1/10 объёма 100% ТХУ.

2. Если минимальная концентрация белка меньше 1 мкг/мл, то к раствору белка добавить 1/10 объёма 0,15% дезоксихолата натрия (соосадитель), выдержать 10 мин при комнатной температуре и добавить 1/20 первоначального объёма 100% ТХУ.

3. Инкубировать 30 мин на льду или 15 мин при -20°С.

4. Центрифугировать 5-10 мин при максимальной скорости центрифуги.

5. Отобрать супернатант пипеткой. Белок - в осадке.

6. Далее можно растворить осадок в 50-100 мкл 0,1н NaOH и промыть 1 мл смеси этанол-эфир 1:1. Для полного удаления остатков ТХУ промывать нужно тщательно, несколько раз подряд.

7. Центрифугировать на максимальной скорости микроцентрифуги. Супернатант отбросить. Осадок белка растворить в буфере PBS.