Молекулярная биология. Практическое руководство - Великов В.А. 2013

Электрофорез белков
Приготовление растворов и заливка ПААГ

Гель-электрофорез - один из стандартных молекулярно-биологических методов анализа. Молекулы белка в растворе обладают зарядом при любом значении pH, отличном от их изоэлектрической точки. Это обуславливает их подвижность в электрическом поле. Разделяют белки в полиакриламидных гелях (ПААГ), имеющих по сравнению с агарозными гелями меньший размер пор. Гель образуется в результате полимеризации мономерных молекул акриламида в присутствии NN’-метилен-бис-акриламида, формирующего поперечные сшивки. Варьированием концентрации мономеров можно добиваться получения пор различного размера. ПАА-гели плотнее агарозных, устойчивы к кипячению в воде, пластичные и менее ломкие.

ПААГ состоит из зон концентрирующего и разрешающего геля. Концентрация акриламида в разрешающем геле зависит от размеров белка - для крупных белков используют гели с низкой концентрацией, начиная от 5% и выше, менее крупные белки разделяют в мелкопористых гелях, содержащих до 20-25% акриламида. Заливка геля и электрофоретическое разделение белков в пластине геля происходит в вертикальном положении.

Разработано большое количество модификаций метода электрофореза белков в ПААГ для решения различных задач и для разных белков и пептидов. Наиболее распространённой разновидностью является электрофорез белков в денатурирующих условиях в присутствии додецилсульфата натрия (хаотропный агент, ПАВ) по Лэммли (Laemmli, 1970). Далее приведена одна из модификаций этого метода.

Подготовка к электрофорезу белков по сравнению с электрофорезом ДНК занимает больше времени. Полиакриламидный гель обычно готовят заранее, используя для этого стоковые растворы.

Концентрирующий гель обычно имеет концентрацию полиакриаламида от 2 до 8% и значение pH 6,8. Разделяющий гель имеет концентрацию полиакриламида от 5 до 20% и pH в районе 8,5-8,9. Выбор плотности геля зависит от молекулярных масс исследуемых белков. В качестве электродного буфера чаще всего используют Tris-глициновый или Tris-боратный буфер с водородным показателем среды pH 8-9.

Материалы и оборудование

Аппарат для вертикального электрофореза, источник постоянного тока, стеклянные пластины с вырезом и без выреза, гребёнка, спейсеры, шприц для нанесения образцов, реактивы для приготовления ПААГ и буферов.

Растворы

Методика

Подготовка стёкол для заливки полиакриламидного геля

1. Взять стекло с вырезом и поместить по его боковым краям два спейсера.

2. Сверху положить на спейсеры стекло без выреза. Осторожно поставить собранную конструкцию в камеру вертикально так, чтобы можно было залить гель в полость между стеклами. Стекло без выреза должно быть обращено наружу, к исследователю. Закрепить конструкцию зажимами.

3. Расплавить 3% агарозу, охладить до 50-60°С и залить тонким слоем (5 мм) дно электрофорезной ячейки во избежание протекания гелевого раствора.

Заливка геля

1. Для приготовления разделяющего геля смешать компоненты ^а (за исключением ТЕМЕД и ПСА) в соответствии с данными, приведёнными в табл. 3 (для разных объёмов!). Полученную смесь тщательно перемешать ^б.

Таблица 3. Подготовка разделяющего геля

2. Добавить последовательно ТЕМЕД и ПСА и тщательно перемешать полученный раствор, при этом важно, чтобы в процессе перемешивания не образовывались пузырьки с газом.

3. Полученный раствор разделяющего геля аккуратно залить между стеклянными пластинами так, чтобы уровень не превышал 3 см от верхнего края пластин.

4. Осторожно наслоить на раствор разделяющего геля тонкий слой метанола или деионизированной воды и оставить гель застывать (до 20 мин).

5. Приготовить раствор концентрирующего геля как указано в табл. 4.

6. Удалить слой метанола (!) или воды с поверхности застывшего разделяющего геля фильтровальной бумагой.

7. Наслоить на поверхность застывшего разделяющего геля раствор концентрирующего геля, и немедленно после этого вставить гребёнку между стеклянными пластинами.

Таблица 4. Подготовка концентрирующего геля

8. Оставить гель застывать в течение 20 мин ^в. Удобно отлить немного из остатков гелевого раствора в 1,7 мл пробирку и использовать этот раствор как индикатор полимеризации.

Подготовка камеры к электрофорезу

1. Поставить электрофорезную камеру на ровную горизонтальную поверхность. Добавить электродный буфер в верхнюю ёмкость камеры так, чтобы уровень буфера был на 0,5 см выше уровня геля.

2. Добавить электродный буфер в нижний поддон камеры.

3. Осторожно удалить гребенку и промыть лунки электрофорезным буфером с помощью шприца или микропипетки.

Примечания

^а Готовый стоковый раствор для геля нужной концентрации без ТЕМЕД и ПСА можно хранить в холодильнике около года. Акриламид токсичен, работать в перчатках!

^б В 15% ПАА-гелях эффективно разделяются белки с диапазоном молекулярных масс 10-45 kDa, в 10% гелях - 14-205 kDa, в 7,5% - 24-205 kDa, в 5% - 36-205 kDa.

^в Готовые гели можно хранить в холодильнике в обёрнутом виде, не вынимая гребёнки. Однако разделяющий и концентрирующий гели имеют разные буферы, поэтому лучше залитый гель использовать сразу.