Молекулярная биология. Практическое руководство - Великов В.А. 2013

Спектрофотометрия препаратов ;ДНК, РНК и белков
Спектрофотометрическое определение концентрации ДНК

Довольно часто количественную и качественную оценку препарату выделенной ДНК в первом приближении дают при гель-электрофорезе, следующем, как правило, сразу за процедурой выделения. Для этого визуально сравнивают на соседних дорожках геля интенсивность свечения в ультрафиолете полученного образца с образцом известной концентрации.

Определить концентрацию ДНК, а также степень её чистоты, можно с помощью спектрофотометра, что точнее и быстрее. Для этого измеряют оптическую плотность раствора ДНК при длине волны 260 нм. Одна (каждая) оптическая единица соответствует концентрации ДНК в 50 мкг/мл. Для расчёта можно воспользоваться калькулятором на интернет-ресурсе MOLBIOL.RU (http://www.molbiol.ru) или других подобных порталах.

Спектрофотометрия (абсорбционная) - физико-химический метод исследования растворов и твёрдых веществ, основанный на изучении спектров поглощения в ультрафиолетовой (200-400 нм), видимой (400760 нм) и инфракрасной (>760 нм) областях спектра. Основная зависимость, изучаемая в спектрофотометрии - зависимость интенсивности поглощения падающего света от длины волны λ. В сооответствии с законом Бугера-Ламберта-Бера оптическая плотность раствора прямо пропорциональна концентрации поглощающего вещества. Нуклеиновые кислоты (НК) поглощают УФ излучение в области 240-290 нм с максимумом при 260 нм. Хромофорами служат азотистые основания НК, особенно пиримидиновые. Пиримидины поглощают УФ свет примерно в 10-20 раз интенсивнее, чем хромофоры белковых молекул - триптофан, тирозин и фенилаланин.

Для оценки чистоты препарата ДНК, свободного от РНК, проводят измерения оптической плотности раствора при длинах волн 260, 280 и 235 нм, т.е. на максимумах поглощения растворов ДНК, белков и полисахаридов, соответственно. Значение соотношения А_260/280 для чистой ДНК должно быть больше 1,8, значение А_260/235 должно быть больше, чем 2,2. Загрязнение полисахаридами характерно, главным образом, для препаратов растительной ДНК. В состав лигнина, в отличие от других углеводов, входят ароматические группировки атомов, и поэтому лигнин поглощает УФ излучение.

Нижний предел концентрации ДНК, которую можно определить спектрофотометрически, составляет 0,1 мкг/мл. На определение обычно берут аликвоту (лат. aliquoties - несколько частей, кратный) исследуемого раствора ДНК, к примеру, 1 мкл и разбавляют в 100 и более раз.

Затем пересчитывают полученное значение концентрации раствора. Важно, чтобы в разведённом образце было более 10 нг ДНК. Для сравнения, при гель-электрофорезе также можно визуализировать полоску, содержащую от 10 нг ДНК. В образце ДНК не должно быть РНК.

Материалы и оборудование

Геномная ДНК из бактерий, клеток крови или тканей кукурузы с неизвестной концентрацией, спектрофотометр, образец ДНК любого происхождения с известной концентрацией.

Растворы

- Раствор ДНК с неизвестной концентрацией в буфере ТЕ.

- Раствор ДНК фага лямбда в буфере ТЕ с концентрацией 1 мг/мл.

Методика

1. Взять микропипеткой на анализ 1 мкл образца полученной ДНК и разбавить препарат, добавив 130 мкл буфера ТЕ, содержащего 100мМ NaCl ^а. Объём образца делают равным 130 мкл, чтобы кривизна поверхности жидкости не влияла на измерения.

2. Поместить образец разбавленной ДНК в «маленькую» (100 мкл) ячейку.

3. Измерить поглощение А₂₆₀. Полученное значение должно лежать в пределах 0,005-2,5 ^б. В противном случае нужно разбавлять или концентрировать ДНК ^в.

4. Рассчитать концентрацию ДНК, используя коэффициент пересчёта из табл. 1 по формуле: С[мкг/мл] = А₂₆₀ х К

Таблица 1. Расчёт концентрации ДНК и РНК

5. Измерить поглощение А₂₈₀ и А₂₃₅, чтобы оценить степень очистки ДНК от примеси белков и полисахаридов. Отношение 260/280, также как и 260/235 должно быть больше чем 1,8. Для чистой ДНК характерны значения А₂₆₀/А₂₈₀ = 1,8—1,9 и А₂₆₀/А₂₃₅ = 2,2-2,5. Для чистой РНК значение А₂₆₀/А₂₈₀ = 1,9—2,0 ^д

6. Откройте главную страницу сайта MOLBIOL.RU (http://www.molbiol.ru). На главной странице найдите раздел «Расчёты», выберите пункт «Спектрофотометрическое определение концентрации ДНК (РНК)» и рассчитайте концентрацию вашего образца с помощью специальной формы.

Примечания

^а Для растворения ДНК (РНК) можно использовать другие низкосолевые буферы, но только не воду. К примеру, растворы 100мМ NaCl, 20мМ Na₃PO₄, 10-100мМ Tris-HCl (pH 7,5-9,0) или 100мМ K₂HPO₄ (pH 8,2) дают сходные результаты. Измерения в воде приводят к существенным отклонениям. Ошибка измерения может составлять до 14% и отношение A₂₆₀/A₂₈₀ оказывается заниженным.

^б Точность измерения падает при слишком больших и слишком малых значениях А₂₆₀ из-за нарушений закона светопоглошения. Ошибка при значении 0,05 составляет ≈ 18%, при значении 0,1-1,0 ≈ 1%. Измерения при значениях свыше 2,5 недостоверны.

^в Концентрируют ДНК путём её переосаждения спиртом (работа 1.4).

^г Для олигонуклеотидов, поглощение которых ощутимо зависит от их состава, существуют специальные расчёты.

^д Эти значения достоверны, если измерение проводится в буферном растворе (например, ТЕ) при нейтральном значении pH.